NISSR
Isolement des souches
A l’aide d’une pipette pasteur flambée 2 à 3 colonies sont isolées L-J. Cependant à partir du milieu liquide, le MGIT fluorescent avec une durée de croissance optimale de 48 à 72 heurs à partir de la date de fluorescence, on prélève à l’aide d’une pipette pasteur 1,5 ml de la suspension bactérienne. Chaque fois, il est nécessaire de faire le repiquage sur MGIT et L-J afin d’avoir à notre disposition des souches fraîches pour une bonne extraction de l’ADN. Les tubes ensemencés sont incubés à 37,5°C.
Préparation des échantillons à la PCR
Extraction de l’ADN
Dans l’intention de mettre au point une méthode d’extraction rapide, moins coûteuse, fiable et simple, nous avons comparé deux méthodes : extraction par le Kit InstaGene matrix proposée par les laboratoires Bio-rad (méthode de référence) et l’extraction par ébullition pendant 5 minutes à partir du L-J et 30 minutes à partir du MGIT.
Extraction par le Kit InstaGene matrix
– prélever une colonie bactérienne et la suspendre dans 1 ml d’eau autoclavée contenue dans un tube microfuge
– centrifuger à 10.000-12.000 rpm pendant 1 ml et enlever le surnageant
– ajouter 200µl d’InstaGene matrix au culot et incuber à 56°C pendant 15-30 minutes
– vortexer à haute vitesse pendant 10 secondes. Placer le tube dans un bloc de chauffage à 100°C ou dans un bain-marie pendant 8 minutes.
– vortexer à haute vitesse pendant 10 secondes.
– centrifuger à 10.000-12.000 rpm pendant 2-3 minutes
– utiliser 8µl du surnageant résultant par 30µl de réaction PCR
– stocker le reste du surnageant à –20°C.
Extraction par ébullition à partir du MGIT
– vortexer pendant 10 secondes le MGIT fluorescent
– prélever 1,5 ml de la suspension
– centrifuger à 8.000 rpm pendant 5 minutes
– resuspendre le culot dans 250 µl de PBS1X
– centrifuger à 8.000 rpm pendant 5 minutes
– resuspendre le culot dans 1 ml d’eau distillée
– vortexer pendant 5 secondes
– chauffer à 95 °C pendant 30 minutes
– centrifuger à 13500 tours/minute à partir du Loweinstein-Jensen
– prélever un ose plein de 1 ou 2 colonies
– resuspendre dans 250 µl de TE
– chauffer 1 ml d’aliquotes au bain-marie pendant 5 minutes
– centrifuger à 8.000 rpm pendant 3 minutes et 30 secondes
– récupérer le surnageant pour l’amplification.
Détermination du M. tuberculosis du complexe tuberculosis
Pour la détermination des souches appartenant au complexe tuberculosis, nous avons choisi le couple d’amorces utilisées par Jan D.A.Van Embden et al (24). Le fragment d’ADN cible à amplifier est celui de la séquence d’insertion IS6110 présente en 6 à 17 copies dans la plupart les souches. Elle est la première séquence d’insertion décrite comme spécifique au complexe tuberculosis (12, 36). Elle possède deux séquences inversées répétées (IR) de 28 paires de bases avec trois nucléotides qui différent entre eux. Les amorces utilisées sont : INS1 et INS2. Un amplicon de 245 paires de bases est attendu. INS1 : 5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC 3’
INS2 : 5’-GCCTAGGCGTCGGTGACAAA 3’
Détermination de l’espèce tuberculosis
Nous avons utilisé pour la détermination de l’espèce les amorces proposées par Patricia Del Portillo et al (36). En effet, c’est le gène codant pour la protéine MTP40 spécifique de l’espèce qui a été amplifié. Les amorces étant PT1 et PT2. Un amplicon de 396 paires de bases est attendu.
PT1 : 5’-CGGCAACGCGCCGTCGGTGG 3’
PT2 : 5’-CCCCCCACGGCACCGCCGGG 3’
Détermination du genre Mycobacterium
Les amorces sont celles proposées par Patricia Del Portillo et al (36). Dans ce cas, c’est le gène codant pour la protéine de surface l’antigène alpha 32 KDa spécifique au genre Mycobacterium qui a été amplifié. Les amorces étant MT1 et MT2. Un amplicon de 506 paires de bases est attendu.
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