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Modèles in vitro de culture cellulaire d’inflammation intestinale
Les progrès technologiques réalisés au cours des 40 dernières années dans le domaine de la culture cellulaire ont permis d’accroitre la recherche sur les troubles intestinaux et les mécanismes physiologiques de la barrière intestinale dans le but de minimiser les expériences in vivo préalables aux essais cliniques. La culture cellulaire est devenue un outil essentiel en toxicologie et en nutrition depuis l’établissement de lignées cellulaires in vitro d’origine animale et humaine. L’utilisation de cultures de cellules primaires est limitée par leur disponibilité, leur répétabilité et leur utilisation dans des études à long terme en raison de leur courte durée de vie, mais les lignées de cellules transformées sont largement utilisées (Langerholc et al. 2011; Zucco et al. 2005). La mise au point de modèles in vitro pour imiter l’environnement in vivo a nécessité la caractérisation de lignées cellulaires en tant que modèles de monoculture ou de co-culture avant de pouvoir être utilisées avec succès. Dans ce contexte, les lignées cellulaires humaines ont été favorisées.
Principales lignées cellulaires intestinales
Lignée cellulaire Caco-2
La lignée de cellules épithéliales humaines Caco-2 a été la lignée cellulaire la plus utilisée comme modèle intestinal pour les études d’absorption, de transport et de biodisponibilité au cours des dernières décennies (Cheng, Li, et Uss 2008; Hidalgo, Raub, et Borchardt 1989; Hillgren, Kato, et Borchardt 1995). Cette lignée cellulaire a été isolée d’un adénocarcinome colorectal humain et établie par Fogh & Trempe en 1974 (Fogh et Trempe 1975). Cette lignée est bien caractérisée en tant que modèle entérocytaire grâce à ses caractéristiques morphologiques et fonctionnelles exprimées après différenciation. Il faut environ cinq jours à ces cellules pour atteindre la confluence et commencer spontanément à se différencier pendant 30 jours de culture. Une fois différenciées, elles forment une monocouche cellulaire polarisée avec des membranes apicales et basolatérales, un complexe de jonction intercellulaires et une bordure en brosse avec des microvillosités du côté apical typiques des entérocytes humains (Isabelle Chantret et al. 1988; Hidalgo, Raub, et Borchardt 1989; Pinto et al. 1983). L’expression d’enzymes telles que les hydrolases (saccharase-isomaltase, lactase, etc.) présentes dans les microvillosités intestinales (I. Chantret et al. 1994; Howell, Kenny, et Turner 1992; Vachon et Beaulieu 1992) et différents transporteurs membranaires sont également des traits de la lignée cellulaire Caco-2 (Lea 2015). Cependant, cette lignée cellulaire présente certaines limites, notamment la formation d’une monocouche hétérogène liée au temps de culture et au nombre de passages (Artursson, Palm, et Luthman 2001) et la présence de zones multicouches (Briske-Anderson, Finley, et Newman 1997). Les conditions de culture peuvent également sélectionner des sous-populations de cellules (Lea 2015). De plus, cette lignée cellulaire n’est pas capable de se différencier en cellules caliciformes, ainsi leur incapacité à produire du mucus est une limitation importante.
Divers clones de Caco-2 ont été établis pour réduire l’hétérogénéité (par exemple, Caco-2 TC7, Caco-2/15, Caco-2/AQ) (Sambuy et al. 2005). Le clone TC7 a été dérivé d’un passage tardif (198) de la lignée Caco-2 et se différencie plus rapidement que la lignée parentale (20 jours vs 30 jours) en conservant ses caractéristiques morphologiques et fonctionnelles et la monocouche formée est plus homogène et stable (Caro et al. 1995; I. Chantret et al. 1994; Ranaldi et al. 2003; Turco et al. 2011). De plus, le clone TC7 s’est avéré être un modèle approprié de la barrière de l’intestin grêle en termes de reproductibilité et de performance (Zucco et al. 2005).
Il a également été démontré que les cellules Caco-2 sont capables de produire des marqueurs inflammatoires (par exemple des cytokines) en réponse à d’autres cytokines telles que l’IL-1β, le TNF-α et / ou l’IFNγ (Hollebeeck et al. 2012; Rodríguez-Ramiro et al. 2013; Węglarz et al. 2006) et / ou dans certains cas, en réponse à des stimuli externes tels que les lipopolysaccharides (LPS) présents sur les membranes des micro-organismes (Barrera et Sánchez 2015; Maccaferri et al. 2012; Węglarz et al. 2006; Xu et al. 2012). Il est important de souligner que des rapports ont également montré que les cellules Caco-2 étaient hypo-réactives à la stimulation avec du LPS en raison de l’expression limitée du récepteur Toll-like impliqué dans la reconnaissance du LPS (TLR-4), même si ces cellules expriment le co-récepteur MD-2, essentiel à l’activation de NF-κB et à la sécrétion subséquente de cytokines pro-inflammatoires (M. Suzuki, Hisamatsu, et Podolsky 2003; Vamadevan et al. 2010).
La lignée cellulaire HT-29 est une autre lignée intestinale établie par Fogh & Trempe. Cette lignée cellulaire est également dérivée d’un adénocarcinome du côlon (Fogh et Trempe 1975) et a été utilisée comme modèle d’entérocytes dans des études de biodisponibilité et de mécanistique cellulaire (Andoh et al. 2001; Hagesaether 2011; Yi et al. 2016). La lignée HT-29 est considérée comme une lignée intestinale pluripotente car les changements dans le milieu de culture peuvent conduire à différentes voies de différenciation. Contrairement à la lignée cellulaire Caco-2, la différenciation des HT-29 n’est pas spontanée mais dépend plutôt des conditions nutritionnelles et de culture (Huet et al. 1987; Viallard et al. 1986; Zweibaum et al. 2011). Dans un milieu sans glucose, de manière similaire à la lignée Caco-2, les cellules HT-29 se différencient en cellules de type entérocyte exprimant des hydrolases telles que la saccharase-isomaltase, limitées à la bordure en brosse intestinale, alors qu’en présence de glucose, elles restent indifférenciées. De plus, la différenciation des cellules HT-29 peut être inhibée et inversée par l’addition de glucose au milieu (Zweibaum et al. 1985). Il existe d’autres différences entre les lignées Caco-2 et HT-29, comme par exemple une période de différenciation plus longue et l’absence d’expression de lactase dans la lignée HT-29. Néanmoins, la différence majeure entre les lignées cellulaires HT-29 et Caco-2 est que, dans certaines conditions de culture, les HT-29 peuvent se différencier en cellules caliciformes et avoir ainsi la capacité de produire du mucus (Zweibaum et al. 2011). Le mucus produit par les cellules caliciformes est un gel insoluble dans l’eau composé principalement d’oligomères de glycoprotéines et de monomères apparentés qui forment une couche protectrice dans l’intestin (Béduneau et al. 2014).
Les cellules HT29, lorsqu’elles sont traitées avec du butyrate de sodium, par exemple, se différencient en phénotypes distincts, comme l’ont démontré Augeron & Laboisse (1984), qui ont isolé différentes sous-populations de HT-29, dont certains clones sont des cellules sécrétrices de mucus et présentent des caractéristiques morphologiques analogues aux cellules caliciformes intestinales (Augeron et Laboisse 1984). Par la suite, lorsque l’accent a été mis sur la capacité des cellules HT-29 à s’adapter aux conditions métaboliques de stress, diverses populations de cellules sécrétant du mucus ont été isolées, dont HT29-FU, HT29-18N2 et HT29-MTX (Huet et al. 1987; T. Lesuffleur et al. 1993). Parmi ces populations, le clone stable HT29-MTX a été isolé sur le principe de la résistance des cellules HT-29 (irréversible) à de fortes concentrations de méthotrexate (MTX), après une adaptation progressive à ce médicament anticancéreux. Ce clone est ainsi capable de se différencier spontanément en cellules productrices de mucus de type caliciforme (Thécla Lesuffleur et al. 1990), lesquelles ont été utilisées par exemple comme modèle pour étudier l’adhésion cellulaire des bactéries lactiques (Turpin et al. 2012).
Les HT29-MTX ont également été largement utilisées dans les systèmes de co-culture avec la lignée cellulaire Caco-2 pour imiter la barrière intestinale humaine dans les études d’absorption et de perméabilité (Barnett et al. 2016; Béduneau et al. 2014; Behrens et al. 2001; Kaulmann, André, et al. 2016; Laparra, Glahn, et Miller 2009; Mahler, Shuler, et Glahn 2009; Nollevaux et al. 2006; Poquet, Clifford, et Williamson 2008; Selby-Pham et al. 2017). Par ailleurs, d’autres lignées cellulaires sécrétant du mucus ont été caractérisées y compris LS174T et LS180 (Tom et al. 1976) et des clones de ces lignées ont été isolés pour étudier les mucines (Kuan et al. 1987).
Une troisième lignée cellulaire fréquemment utilisée dans les études intestinales est la lignée T84, établie en 1980 par Murakami et Masui pour étudier le contrôle hormonal de la croissance cellulaire du carcinome du colon humain (Murakami et Masui 1980). Les cellules T84 se développent en monocouches de cellules polarisées qui montrent la présence de TJs et de microvillosités à la surface (Dharmsathaphorn et al. 1984). Contrairement à la différenciation spontanée des Caco-2, une particularité de la lignée cellulaire T84 est leur possible différenciation en cellules des cryptes intestinales (Madara et Dharmsathaphorn 1985) après induction par le facteur de croissance transformant humain recombinant (TGF-β1) ou d’autres facteurs solubles provenant des cellules mésenchymateuses. Cette caractéristique permet d’étudier le processus de différenciation (K. M. Juuti-Uusitalo et al. 2006).
Les cellules T84 ont également été utilisées pour étudier des mécanismes de transport des électrolytes (Alzamora et al. 2011; Beltrán et al. 2015; Nichols et al. 2015; Tang et al. 2010) et la perméabilité intestinale (Ewaschuk et al. 2008; H. Huang et al. 2016; Watson et al. 2005). En outre, cette lignée cellulaire a aussi été utilisée dans des études sur les voies de signalisation liées à la réponse inflammatoire de l’épithélium intestinal (Cario et al. 2000; J. A. Cho et Park 2015; de Kivit et al. 2011; K. Juuti-Uusitalo et al. 2011; Ou et al. 2009; Vamadevan et al. 2010) et l’interaction bactéries-entérocytes (Otte et Podolsky 2004).
Malgré l’utilisation très répandue des Caco-2, HT29 et T84, il est nécessaire de préciser qu’il existe d’autres lignées cellulaires intestinales humaines (par exemple, SW480, H4) ainsi que des modèles de cellules animales (Langerholc et al. 2011; Leibovitz et al. 1976). Dans ce contexte, un profil d’expression génique de certaines de ces lignées intestinales couramment utilisées a été publié en 2012 afin d’orienter le choix du modèle in vitro le plus approprié pour des études spécifiques (Bourgine et al. 2012).
Ainsi, ces modèles in vitro permettent l’étude simple et reproductible de mécanismes cellulaires au niveau moléculaire difficiles à réaliser in vivo. Actuellement, des inserts en polycarbonate avec des membranes semi-perméables utilisés comme systèmes de culture facilitent l’observation des molécules se déplaçant à travers la monocouche cellulaire (systèmes compartimentés).
En conséquence, ces dernières années, de nombreuses études ont été réalisées pour caractériser l’absorption, le transport et la biodisponibilité de composants alimentaires ou de molécules d’intérêt thérapeutique. Même si l’on doit faire preuve de prudence lors de la comparaison des résultats in vitro et in vivo, ces travaux de recherche permettent toutefois de fournir des informations intéressantes.
Co-cultures de cellules intestinales et immunitaires comme modèle d’inflammation
Dans l’objectif d’améliorer les modèles cellulaires simples, des systèmes de co-culture 2D ou 3D associant plusieurs types cellulaires ont été développés en tant que modèles d’inflammation intestinale et sont présentés dans les tableaux de synthèse en annexe. Depuis la fin des années 1990, un intérêt croissant est observé pour l’amélioration des modèles de barrière intestinale en incluant des cellules immunitaires dans les cultures (Kernéis et al. 2000) en présence ou non d’une matrice extracellulaire. Les principales cellules immunitaires utilisées pour établir ces systèmes de co-culture avec des lignées cellulaires intestinales comprennent des cellules primaires comme les cellules mononuclées du sang périphérique humain (PBMC) et des lignées cellulaires de type macrophage d’origine humaine (THP-1) ou murine (RAW 264.7).
Principales lignées cellulaires immunitaires utilisées en co-culture
PBMC
Les PBMC sont obtenues à partir des couches leuco-plaquettaires de donneurs sains généralement par centrifugation en gradient de Ficoll et comprennent les lymphocytes, les monocytes et les cellules dendritiques. La présence de marqueurs cellulaires pour les macrophages et les cellules dendritiques a été décrite dans des co-cultures utilisant des PBMC (Leonard, Collnot, et Lehr 2010). Cependant, compte tenu de leurs différences de phénotype, les cellules isolées du sang pourraient présenter des réponses différentes de celles présentes dans la lamina propria intestinale (Kleiveland 2015).
Lignée cellulaire THP-1
La lignée cellulaire THP-1 a été isolée à partir du sang périphérique d’un patient de 1 an souffrant de leucémie monocytaire aiguë et caractérisée en tant que lignée cellulaire monocytaire (Tsuchiya et al. 1980). Ces cellules peuvent être cultivées in vitro pendant environ 3 mois (passage 25) sans modification de la sensibilité ou de l’activité cellulaire. Les cellules THP-1 peuvent se différencier en macrophages sous traitement au phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) ou en cellules dendritiques en les transférant dans un milieu sans sérum et en les traitant ensuite avec un mélange d’IL-4, GM-CSF, TNF-α et ionomycine (Chanput, Peters, et Wichers 2015). Cette lignée cellulaire a été caractérisée comme un modèle de modulation immunitaire (Chanput et al. 2013; Chanput, Mes, et Wichers 2014) et a également été largement utilisée pour étudier la production de ROS et l’inflammation. Par exemple, la lignée cellulaire THP-1 a été utilisée comme modèle pour analyser les effets anti-inflammatoires des polyphénols (Chanput et al. 2010; S.-M. Huang, Wu, et Yen 2006; C.-H. Wu et al. 2011) ou des acides gras (S. Huang et al. 2012). L’utilisation des THP-1 pourrait présenter certains avantages par rapport aux PBMC, en raison de son origine génétique homogène qui réduit la variabilité du phénotype cellulaire, améliorant ainsi la reproductibilité des expériences.
Lignée cellulaire RAW 264.7
Parmi les lignées immunitaires fréquemment utilisées on trouve aussi la lignée monocytaire murine RAW 264.7. Cette lignée a été établie à partir d’une tumeur murine induite par le virus de la leucémie d’Abelson et présente des propriétés des macrophages (Raschke et al. 1978). Il a été démontré que ces cellules ressemblent aux macrophages dérivés de la moelle osseuse murine en termes de récepteurs de la surface cellulaire et de réponse aux ligands microbiens impliquant des récepteurs Toll-like (TLRs) (Berghaus et al. 2010). Cependant, ces mêmes auteurs ont conclu de rester prudent concernant l’interprétation et l’extrapolation des résultats en raison de possibles changements dans les cellules RAW en culture continue (Berghaus et al. 2010). De plus, des possibles réactions croisées inter-espèces devraient également être prises en compte dans les modèles de co-culture qui combinent des lignées cellulaires murines (par exemple, des cellules RAW) et humaines telle que les cellules Caco-2, pour étudier des effets anti-inflammatoires.
Modèles de co-culture 2D
L’établissement de co-cultures de différents types de cellules permet alors d’étudier la communication cellule-cellule (intercellulaire) et d’étudier l’influence de ces interactions sur la croissance, la différenciation et la réponse immunitaire. Cela permet également d’explorer l’effet des composants alimentaires et la réponse des cellules à l’exposition à ces composants dans des conditions de bonne santé ou pathologiques. Même si les modèles in vitro ne reproduisent pas complètement la complexité de la physiologie humaine, ces modèles facilitent l’étude des mécanismes de contact cellulaire et des réponses à des facteurs solubles tels que les cytokines. Un tableau de synthèse listant les différents modèles 2D d’inflammation intestinale est présenté en annexe A.
Actuellement, la plupart des modèles de co-culture impliquant des cellules intestinales et immunitaires utilisent des systèmes de culture sur insert dans lesquels les deux types cellulaires ne sont pas en contact direct. Ce système est constitué de deux compartiments distincts (apical et basal) séparés par une membrane poreuse. Cependant, il existe quelques études dans lesquelles des cellules à la fois intestinales et immunitaires ont été ensemencées dans le même compartiment (Susewind et al. 2016) ou en utilisant des modèles inversés (Araújo et al. 2016; des Rieux et al. 2007; Mori, Satsu, et Shimizu 2003; P. C. Tyrer et al. 2011). Cela permet un contact direct entre les deux types de cellules et donc l’étude de la migration des cellules immunitaires dans la monocouche intestinale.
Pourtant, les modèles de culture cellulaire 2D présentent certaines limites, notamment des interactions intercellulaires réduites, le manque d’interactions cellule-matrice et l’architecture des tissus n’est pas complètement recréée. Fitzgerald et al. (2015) ont examiné ces inconvénients en termes d’évaluation de nouvelles stratégies d’administration de médicaments (Fitzgerald et al. 2015). Malgré leurs limites, les modèles 2D in vitro sont un outil utile pour étudier les interactions entre les composants alimentaires et les cellules intestinales au cours d’une inflammation intestinale. À ce jour, seules quelques études ont associé les effets des composants alimentaires à l’inflammation intestinale en utilisant des modèles de co-culture 2D. Quelques exemples seront présentés ultérieurement, dans la partie 3 de cette révision bibliographique.
Modèles de co-culture 3D
Les modèles in vitro évoluent constamment, allant des monocultures simples aux cultures 3D dans lesquelles les cellules sont cultivées au sein d’une matrice extracellulaire (MEC), en passant par les co-cultures 2D utilisant des supports plastiques, comme observé précédemment. Un tableau de synthèse des différents modèles 3D existants est présenté en annexe B.
Kim et al. (2014) ont observé des différences dans la fonction de barrière (perméabilité) entre un modèle 2D et un modèle de villosités 3D utilisant des cellules Caco-2 (S. H. Kim et al. 2014). De même, Yu et al. (2012) ont signalé des variations au cours de la différenciation cellulaire entre les modèles 2D et 3D, avec une différenciation cellulaire plus réaliste dans le modèle 3D le rendant plus efficace (Yu et al. 2012). Une autre des limites des modèles 2D, en particulier dans la recherche sur les tumeurs, est l’absence d’une véritable MEC avec des modifications de la structure, du potentiel d’adhésion, de la mécano-transduction et des résultats d’exposition à des facteurs solubles (Ryan et al. 2016). En effet, la MEC confère aux tissus des propriétés mécaniques et favorise la communication cellulaire. L’ancrage des récepteurs membranaires à la MEC régule l’interprétation par les cellules des signaux de leur environnement (Abbott 2003). Grâce aux progrès de la bio-ingénierie, des systèmes de co-culture 3D ont été conçus en utilisant différentes plates-formes : structures d’échafaudages, hydrogels (collagènes, laminines), des sphéroïdes ou encore dispositifs micro-fluidiques avec des canaux capables de contrôler la diffusion de nutriments (Fitzgerald et al. 2015). Par exemple, Juuti-Uusitalo et al. (2011) ont utilisé des modèles 3D (cellules T84 et Caco-2) pour étudier l’effet du TNF (TNFSF2) et de l’INFγ sur la morphogenèse et la perméabilité de l’épithélium intestinal. Leur travail a révélé des différences dans la réponse aux stimuli en utilisant un modèle 3D, et a montré que l’apoptose est un mécanisme important dans l’augmentation de la perméabilité après la stimulation avec le TNF. Ils ont également montré que cette cytokine pro-inflammatoire inhibe la morphogenèse épithéliale intestinale normale entraînant la formation de monocouches «perméables» dans le cas du modèle 3D avec des cellules T84 (K. Juuti-Uusitalo et al. 2011).
Au vu de la littérature, la plupart de ces modèles 3D et dispositifs micro-fluidiques ont été appliqués dans le domaine pharmaceutique en mettant l’accent sur la toxicologie et le criblage des médicaments. Par exemple, Leonard et al. (2010, 2012) ont établi un modèle 3D d’intestin inflammé utilisant la lignée Caco-2 (C2Bbe1) et les PBMC en tant que cellules immunitaires enrobées par une couche de collagène. Le modèle a été utilisé pour évaluer l’efficacité de différentes formulations d’un médicament anti-inflammatoire (budésonide) utilisé dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Leurs résultats montrent la capacité du modèle à différencier l’efficacité thérapeutique entre différentes formulations tout en représentant de manière adéquate les modifications physiopathologiques complexes observées in vivo (Leonard, Collnot, et Lehr 2010; Leonard et al. 2012). Li et al. (2013) ont également développé un modèle intestinal 3D impliquant des cellules intestinales (Caco-2, HT29MTX), des cellules de type fibroblastes (MEFs,P0) et des cellules de type macrophages (THP-1) enrobées par une matrice de collagène, afin d’étudier l’absorption de médicaments. Les auteurs ont conclu que leur modèle imite plus étroitement la couche épithéliale intestinale native. Ils ont également démontré une corrélation améliorée entre la perméabilité à l’absorption à travers le modèle de co-culture 3D et la fraction absorbée dans l’intestin humain dans le cas de médicaments modérément et fortement perméables (Li et al. 2013).
Plus récemment, Wu et al. (2017) ont évalué la toxicité et les effets inflammatoires des nanoparticules de ZnO (NP ZnO) à l’aide de modèles de culture cellulaire 2D et 3D utilisant les cellules Caco-2. Leurs résultats ont montré que les NP ZnO induisaient une réponse inflammatoire chronique dans la culture cellulaire 2D et une réponse inflammatoire aiguë dans la culture cellulaire 3D, indiquant que l’organisation de l’espace cellulaire a un impact important sur les réponses cellulaires (Z. Wu et al. 2017). Même si, actuellement, la plupart des recherches utilisant des modèles 3D ont des objectifs pharmaceutiques, de tels modèles pourraient être utilisés dans le domaine de l’alimentation pour étudier l’absorption et les propriétés antioxydants et / ou anti-inflammatoires de composés alimentaires bioactifs lors de l’inflammation intestinale.
Pour aller encore plus loin dans la modélisation, des modèles plus complexes ont été développés. Ces dispositifs micro-fluidiques souvent appelés « organs-on-chips » or « biochips » ont pour objectif de fournir un microenvironnement cellulaire qui rapproche les conditions in vitro à la réalité physiologique de l’organisation et des propriétés dynamiques des tissus. Le développement de ces « biochips », passant de cultures statiques à cultures fluidiques, ouvre de nouvelles opportunités pour comprendre les interactions au niveau des organes. Dans le domaine de l’alimentation, ils pourraient être utilisés pour étudier l’absorption des nutriments et l’impact des composants alimentaires sur la modulation de l’immunité. Par exemple, une nouvelle plate-forme micro-fluidique intégrée, appelée « Nutrichip », a été développée pour étudier le potentiel de la fonction immunomodulatrice des produits laitiers (Ramadan et al. 2013; Vergères et al. 2012). Ce système consiste en une monocouche de cellules épithéliales interagissant avec des cellules immunitaires montées sur un dispositif porte-puce. Différents micro-canaux de perfusion permettent un flux de fluide radial uniforme du milieu de culture ou encore un stimulus inflammatoire ou un digestat. La production de cytokines est quantifiée à l’aide d’un dosage immunomagnétique sur puce. Plus récemment, un modèle de co-culture miniaturisé similaire Caco-2 / U937 a été utilisé pour caractériser la perturbation des TJs et la modulation de la réponse immunitaire au niveau intestinal (Ramadan et Jing 2016).
Des recherches supplémentaires sont encore nécessaires pour contrôler complètement toutes les fonctionnalités des modèles (Pampaloni, Reynaud, et Stelzer 2007; Ravi et al. 2015). Par exemple, la composition et la rigidité de la MEC (Langhans 2018; Wallace et Rosenblatt 2003), les échanges gazeux, le contrôle des signaux chimiques et mécaniques et les flux interstitiels ont un impact crucial sur le comportement et les réponses des cellules (Griffith et Swartz 2006). L’utilisation de ce type de modèles présente d’autres défis associés, notamment l’impact de la densité d’ensemencement sur la réponse et le développement des cellules, comme cela a été démontré pour d’autres types de tissus (Dvir-Ginzberg et al. 2003; Holy, Shoichet, et Davies 2000; Ohnuma, Arkin, et Holland 1986; Watt 1988). L’optimisation de ces modèles est donc nécessaire pour pouvoir mieux corréler les résultats des modèles 3D et ceux obtenus in vivo.
Enfin, il convient de souligner que les avancées récentes en matière de méthodes de culture de cellules souches épithéliales intestinales humaines, telles que la découverte des facteurs de croissance nécessaires à l’homéostasie des cellules souches, ont permis la création de systèmes de culture à long terme : les organoïdes intestinaux humains (HIO) et entéroïdes / colonoïdes (HIE). Ces modèles ex vivo et in vitro reproduisent les caractéristiques physiologiques de l’intestin humain in vivo (Zachos et al. 2015). Les HIOs sont établies in vitro à l’aide de cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) ou de cellules souches embryonnaires (ESCs) (Spence et al. 2011; McCracken et al. 2011). Les HIEs sont développés à partir de cellules souches/cryptes dissociées de tissus intestinaux (Sato et al. 2011; Saxena et al. 2015). Contrairement à d’autres techniques de culture qui contiennent des cellules d’origine mésenchymateuse, les HIEs permettent l’étude de cellules épithéliales isolées (VanDussen et al. 2014). Les modèles d’HIEs sont cultivés en monocouches ou en formes 3D (sphéroïdes) en utilisant du « Matrigel® » comme MEC (VanDussen et al. 2014; Costantini et al. 2018). Ces modèles comprennent plusieurs types de cellules différenciées (entérocytes, cellules caliciformes, cellules entéroendocrines et cellules de Paneth) et pourraient être établis à partir de différents segments de l’intestin, ce qui pourrait aider à mieux comprendre les fonctions de régions spécifiques (Middendorp et al. 2014). Les modèles d’HIEs sont dérivés de tissus de l’intestin grêle et du côlon non transformés, établis à partir de biopsies des sujets (VanDussen et al. 2014) ou de tissus intestinaux réséqués chirurgicalement (Sato et al. 2011). Cela pourrait être considéré comme un inconvénient en raison de problèmes éthiques, mais cela pourrait aussi être envisagé comme un avantage, car cela pourrait simplifier l’étude des variations individuelles de la fonction épithéliale humaine. Cependant, les inconvénients de ce type de systèmes de culture cellulaire incluent le coût élevé (facteurs de croissance) et le fait qu’ils nécessitent beaucoup de travail (Costantini et al. 2018).
Récemment, des chercheurs ont utilisé des modèles HIE pour étudier les norovirus et les rotavirus (propagation par des aliments / de l’eau) (Ettayebi et al. 2016; Saxena et al. 2015, 2017; Costantini et al. 2018). Ainsi, les organoïdes et les entéroïdes / colonoïdes pourraient être utiles dans d’autres secteurs de la recherche dans le domaine de l’alimentation et au-delà. Par exemple, la possibilité de les co-cultiver avec des cellules immunitaires ou des micro-organismes permettrait de générer des modèles intestinaux plus complexes afin d’étudier l’inflammation intestinale.
Composés bioactifs de l’alimentation : transport et potentiel antioxydant / anti-inflammatoire dans les modèles de culture cellulaire intestinale
Les composés bioactifs présents dans l’alimentation présentent des avantages intéressants pour la santé, notamment en raison de leur potentiel anti-inflammatoire et antioxydant. Des modèles cellulaires intestinaux en mono- ou co-culture ont été alors utilisés dans le but d’étudier ces propriétés ainsi que leur effet sur la perméabilité intestinale, sans oublier leur absorption, transport et biodisponibilité.
Par exemple, des travaux ont été effectués en associant les cellules Caco-2 à la lignée cellulaire RAW 264.7 pour étudier les effets anti-inflammatoires d’extraits naturels des plantes. Une étude a mis en évidence les propriétés anti-inflammatoires d’un jus de fruit enrichi en extrait d’écorce de pin, lesquelles diminuent après la digestion (Frontela-Saseta et al. 2013). D’autres études ont montré que des extraits de fruits (par exemple de sureau) et de feuilles (par exemple de bambou) régulaient à la baisse l’expression de gènes codant pour des cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, IL-6, TNF-α) et d’enzymes liées à l’inflammation (iNOS, COX) (K.-M. Kim et al. 2015; Olejnik et al. 2015).
Récemment, Kaulmann et al. (2016) ont associé deux lignées cellulaires intestinales (Caco-2 / HT29 MTX) à des cellules THP-1 pour étudier la capacité anti-inflammatoire et anti-oxydante de digestats de prunes et de choux. Leurs résultats ont révélé une réduction de certains marqueurs d’inflammation (IL-6, IL-8 et NF-κB) et de stress oxydant (Nrf2), bien que les effets aient été modérés et ne puissent pas être attribués aux choux ou aux prunes ou encore aux polyphénols ou aux caroténoïdes présents dans ces aliments (Kaulmann, Legay, et al. 2016).
Cas des polyphénols
Ainsi, les effets santé possibles des polyphénols ont largement été étudiés dans des modèles cellulaires. Par exemple, Kosińska et Andlauer (2012) ont étudié les flavan-3-ols d’un extrait purifié de cacao en poudre et ont montré que ces flavonoïdes pourraient augmenter la perméabilité de la monocouche de Caco-2 sans effet nocif sur les cellules, augmentant ainsi la biodisponibilité des flavan-3-ols (Kosińska et Andlauer 2012). Denis et al. (2015) ont également démontré la capacité des fractions phénoliques issus de canneberge à réduire le stress oxydant intestinal et l’inflammation tout en améliorant le dysfonctionnement mitochondrial en utilisant le clone cellulaire Caco-2/15 comme modèle (Denis et al. 2015). De même, les résultats obtenus par Bitzer et al. (2015) dans une étude utilisant les lignées cellulaires Caco-2 et HT29 suggèrent que les procyanidines polymériques de cacao de haut poids moléculaire sont très efficaces pour préserver l’intégrité de la membrane (dans les cellules Caco-2) et réduire les marqueurs inflammatoires tels que l’IL-8 (dans les cellules HT29) (Bitzer et al. 2015). Plus récemment, Martins et al. (2017) ont publié une étude sur les effets antioxydants et anti-inflammatoires du marc de raisin, lequel est riche en polyphénols polymériques et glycosidiques. Ces auteurs ont montré une réduction de la production de marqueurs inflammatoires (IL-8, PGE2) par les cellules Caco-2 stimulées par l’IL-1β après l’addition de tannase (tanin acyl hydrolase) aux cultures, suggérant une amélioration des activités antioxydantes et anti-inflammatoires des extraits de polyphénols de marc de raisin (Martins et al. 2017).
De la même façon, l’effet positif du kaempférol sur l’intégrité des jonctions serrées de la barrière a été étudié en utilisant des cellules Caco-2/HTB-37 mettant en évidence une amélioration de l’assemblage des protéines des jonctions serrées après administration de flavonoïdes (T. Suzuki, Tanabe, et Hara 2011). Rodriguez-Ramiro et al. (2013) ont étudié le mécanisme moléculaire lié à l’activité anti-inflammatoire des polyphénols et ont conclu que les polyphénols de cacao régulent efficacement la diminution de taux de marqueurs inflammatoires in vitro (cellules Caco-2) et in vivo (modèle de rat) (Rodríguez-Ramiro et al. 2013). Un concentré riche en flavonoïdes provenant du jus d’une espèce de cactus (Opuntia ficus indica) a été évalué par Matias et al. (2014) et leurs résultats ont montré que la co-incubation du concentré avec un inducteur de stress atténuait considérablement la production de radicaux libres par rapport à la pré-incubation. Ceci suggère que certains des composés principaux présents dans le concentré, par exemple, les dérivés d’isorhamnétines qui présentent une faible biodisponibilité inhibent la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans l’environnement des cellules intestinales épithéliales. Une réponse positive similaire concernant l’activité inflammatoire a été aussi observée pendant la co-incubation (Matias et al. 2014). Toutes ces études in vitro démontrent le potentiel antioxydant et anti-inflammatoire des polyphénols habituellement présents dans les fruits et légumes.
Cas des caroténoïdes
Le transport (During et al. 2002; Reboul et al. 2005; Ferruzzi et al. 2006; Dhuique-Mayer et al. 2007; During et Harrison 2007; Failla, Chitchumroonchokchai, et Ishida 2008; Reboul et Borel 2011; Reboul 2013; Failla et al. 2014) et l’effet anti-inflammatoire (Kaulmann et al. 2012) des caroténoïdes ont également été étudiés à l’aide de modèles de culture cellulaire. Kaulmann et al. (2012) ont étudié l’effet anti-inflammatoire de lycopène et du β-carotène à des concentrations observables dans l’alimentation (10–25 mg/ml) en utilisant la lignée Caco-2 comme modèle. Leurs résultats ont montré que ces deux caroténoïdes sous leur forme isolée n’avaient pas d’effet anti-inflammatoire sur les marqueurs mesurés (IL-8, COS-2, NF-κB). Par contre, ils ont observé grâce à des analyses protéomiques des changements dans la régulation de quinze protéines impliquées dans des mécanismes antioxydants (par exemple, glutathione S-transferase A1) lors que les cellules étaient exposées au β-carotène (Kaulmann et al. 2012). De la même façon, la lignée cellulaire Caco-2 a été associée aux cellules THP-1 pour étudier les effets du lycopène, un caroténoïde présent dans les fruits rouges et légumes, sur des cibles pro-inflammatoires. Les auteurs de cette étude ont constaté qu’une faible concentration (2 µM) de lycopène renforçait l’expression génique pro-inflammatoire dans les cellules THP-1, alors que des concentrations plus élevées (5-20 µM) avaient un effet anti-inflammatoire avec une diminution des ROS (Makon-Sébastien et al. 2014).
Toutefois, d’après la littérature, la β-cryptoxanthine (BCX), caroténoïde pro-vitaminique A le plus présent dans la mandarine et l’orange (Lin et Chen 1994; Dhuique-Mayer et al. 2005; Giuffrida et al. 2006) et présentant un effet antioxydant connu (Lorenzo et al. 2009; Navarro et al. 2011; Chisté et al. 2014) ainsi qu’un effet préventif du cancer de côlon (Narisawa et al. 1999; Tanaka et al. 2012; Cilla et al. 2015) a très peu été étudiée sur modèle in vitro. O’Sullivan et al. ont fait une comparaison de l’absorption et sécrétion de différents caroténoïdes, y compris la BCX sur des cellules Caco-2 montrant que la BCX présentait le plus faible pourcentage d’absorption et sécrétion parmi les xanthophylles étudiés (O’Sullivan, Ryan, et O’Brien 2007). Dhuique-Mayer et al. (2007) ont utilisé le clon TC7 de la lignée Caco-2 pour évaluer l’absorption de la BCX et ses formes estérifiées et leurs résultats montrent une meilleur absorption de la forme libre de la BCX par rapport aux formes estérifiées (Dhuique-Mayer et al. 2007). Des travaux pour étudier la capacité de la BCX à protéger des dommages causés par l’oxydation de l’ADN (Lorenzo et al. 2009) et l’effet de la BCX sur la prolifération cellulaire (Cilla et al. 2015) ont été aussi réalisés en utilisant le modèle Caco-2. Lorenzo et al. (2009) ont trouvé un effet protecteur de la BCX sur les dommages induits sur l’ADN par H2O2 ou par la lumière visible en présence d’un photosensibilisateur dans les cellules en plus d’accélérer la réparation de l’ADN endommagé (Lorenzo et al. 2009). Dans une autre étude, Cilla et al. (2015) ont montré l’activité antiproliférative de la BCX par la voie mitochondriale de l’apoptose (Cilla et al. 2015). L’effet préventive de la BCX envers le cancer pourrait alors être liée aux effets de la BCX sur la réparation de l’ADN et à ses propriétés antioxydantes.
Ainsi, les monocultures cellulaires ont été largement utilisées pour évaluer la modulation de la réponse immunitaire, les effets antioxydants et anti-inflammatoires de différents composants des végétaux mais également d’autres produits naturels tels que les lipides du lait maternel ou l’acide phytique (Barrera et Sánchez 2015; Hollebeeck et al. 2012; Kang et al. 2009; Sergent et al. 2010; Węglarz et al. 2006; Wojtal et al. 2013; Xu et al. 2012). Shimizu et al (2010) ont décrit et examiné dans une revue générale les différentes études sur l’interaction des composants alimentaires avec l’épithélium intestinal en utilisant la lignée Caco-2 comme modèle cellulaire en particulier les voies de transport, la modulation des fonctions des transporteurs, la perméabilité des jonctions serrées et la régulation du système immunitaire (Shimizu 2010).
Il convient également de souligner que les additifs alimentaires, les adjuvants ou les matrices alimentaires peuvent influencer le transport intestinal et la biodisponibilité de ces composés bioactifs (Nerurkar, Burton, et Borchardt 1996) ou avoir une influence directe sur la fonction intestinale (Jiang 2013). Récemment, Lefebvre et al (2015) ont examiné les études sur l’interaction des nanomatériaux utilisés dans l’industrie alimentaire avec des modèles intestinaux, y compris les cultures cellulaires (Lefebvre et al. 2015). La migration des matériaux en contact avec les aliments tels que les nanoparticules d’argent (AgNPs) provenant des ustensiles et des récipients de stockage ainsi que de leur impact sur la perméabilité intestinale ont été étudié, à l’aide de la lignée cellulaire T84. Ces auteurs ont conclu que les AgNPs de petite taille pouvaient augmenter la perméabilité intestinale, même en absence d’effets toxiques sur les cellules (Williams et al. 2016). Ces modèles en monoculture présentent des limites et restent éloignés de la complexité de l’intestin. Pour autant, il n’existe que très peu d’études à ce jour utilisant des modèles in vitro plus complexes, de co-culture cellulaire en 2D ou 3D pour évaluer le potentiel des composés bioactifs sur la santé.
Table des matières
INTRODUCTION
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Caractéristiques de la barrière intestinale saine et inflammée
2. Modèles in vitro de culture cellulaire d’inflammation intestinale
2.1. Principales lignées cellulaires intestinales
2.1.1. Lignée cellulaire Caco-2
2.1.2. Lignée cellulaire HT-2
2.1.3. Lignée cellulaire T
2.2. Co-cultures de cellules intestinales et immunitaires comme modèle d’inflammation
2.2.1. Principales lignées cellulaires immunitaires utilisées en co-culture
2.2.1.1. PBMC
2.2.1.2. Lignée cellulaire THP-1
2.2.1.3. Lignée cellulaire RAW 264.7
2.2.2. Modèles de co-culture 2D
2.2.3. Modèles de co-culture 3D
3. Composés bioactifs de l’alimentation : transport et potentiel antioxydant / anti-inflammatoire dans les modèles de culture cellulaire intestinale
3.1. Cas des polyphénols
3.2. Cas des caroténoïdes
MATERIEL ET METHODES
1. Culture cellulaire
1.1. Lignées cellulaires et conditions de culture
1.2. Essais préliminaires pour la mise au point des conditions du modèle de tri-culture cellulaire
1.3. Mise en place du modèle de tri-culture Caco-2 TC7 / HT29MTX / THP-1 en état d’inflammation
2. Caractérisation de la couche de mucus
2.1. Coloration du mucus au bleu Alcian
2.2. Coloration histochimique du mucus
3. Cytotoxicité cellulaire par mesure de la LDH
4. Evaluation de la perméabilité intestinale
4.1. Mesure de la résistance électrique transépithéliale (TEER)
4.2. Transport du rouge de phénol
5. Marquage immunofluorescent du mucus et des jonctions serrées
6. Expression génique des marqueurs d’inflammation (RT-qPCR)
7. Quantification des cytokines pro-inflammatoires par ELISA
8. Interaction de la β-cryptoxanthine (BCX) avec le modèle in vitro d’inflammation intestinale
8.1. Préparation des micelles-BCX (artificielles et physiologiques)
8.1.1. Préparation des micelles Tween
8.1.2. Préparation des micelles physiologiques
8.2. Interaction de la BCX avec le modèle d’inflammation en tri-culture
9. Analyse statistique
RESULTATS
1. Modèle in vitro d’inflammation intestinale
1.1. Détermination des conditions optimales du développement du modèle
1.2. Caractérisation de la production de mucus dans la biculture
1.3. Effets de la stimulation par le LPS et l’IFNγ à faible dose sur le modèle cellulaire d’inflammation intestinale
1.3.1. Cytotoxicité et perméabilité épithéliale
1.3.2. Marquage immunofluorescent des jonctions serrées (microscopie confocale)
1.3.3. Marqueurs d’inflammation en condition de faible stimulation par le LPS et l’IFNγ
1.4. Effets de la stimulation par le LPS et l’IFNγ à forte dose sur le modèle cellulaire d’inflammation
intestinale
1.4.1. Cytotoxicité et perméabilité épithéliale
1.4.2. Marqueurs d’inflammation en condition de forte stimulation par le LPS et l’IFNγ
2. Interaction de la β-cryptoxanthine (BCX) avec le modèle in vitro d’inflammation intestinale
2.1. Utilisation de micelles artificielles contenant la BCX
2.1.1. Cytotoxicité
2.1.2. Influence des micelles artificielles de BCX sur la production de cytokines pro-inflammatoires
2.1.3. Transport de la BCX à travers la monocouche cellulaire
2.2. Utilisation des micelles physiologiques contenant la BCX
2.2.1. Cytotoxicité et perméabilité épithéliale
2.2.2. Influence des micelles physiologiques de BCX sur la production de cytokines proinflammatoires
2.2.3. Transport de la BCX à travers la monocouche cellulaire
2.3. Utilisation des micelles physiologiques contenant la BCX en prévention
2.3.1. Cytotoxicité et perméabilité épithéliale
2.3.2. Influence des micelles physiologiques de BCX sur la production de cytokines proinflammatoires
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
CONCLUSION
ANNEXES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
