Ligands de structures G-quadruplex d’acides nucléiques

Ligands de structures G-quadruplex d’acides nucléiques

Les G-quadruplex d’acides nucléiques

Généralités

Les nucléotides sont les briques constitutives du génome. Fondations des acides nucléiques du vivant que sont l’Acide DésoxyriboNucléique (ADN) et de l’Acide RiboNucléique (ARN), ils sont constitués d’un sucre de type ribose ou 2- désoxyribose, d’un groupement phosphate et d’une base azotée. La structure des principales bases constitutives de l’ADN et de l’ARN ainsi qu’un enchaînement de plusieurs nucléotides formant un brin d’ADN sont présentés sur la Figure 1. La liaison entre nucléotides est une liaison phosphodiester, elle se fait entre le groupement hydroxyle en 3’ d’un nucléotide et le groupement hydroxyle en 5’ du suivant. Une séquence d’ADN se lit de l’extrémité 5’-OH libre vers l’extrémité 3’-OH libre. Les interactions entre les différents nucléotides permettent la structuration des brins. La structure la plus connue est celle de l’ADN double brin permise par les interactions de type liaisons hydrogènes entre les nucléotides deux à deux. Ces liaisons hydrogène se font par appariement sur la face appelée Watson-Crick (en violet sur la Figure 1) 1 . Le Prix Nobel de médecine1 qui a été attribué en 1962 à ces auteurs, sur la base des travaux de Rosalind Franklin a marqué l’importance de cette structure. Ces appariements dits canoniques concernent les interactions entre les bases adénine (A) et thymine (T), cytosine (C) et guanine (G), deux à deux de type A=T et C≡G. L’appariement en double brin d’ADN n’est pas le seul existant cependant. Des appariements de plusieurs types sont connus également, entre des bases non canoniques par exemple ou suivant une face différente de la face WatsonCrick, qui permettent des structurations différentes indispensables au bon fonctionnement d’un organisme vivant. Ce sont ces dernières qui vont nous intéresser plus particulièrement. Figure 1 : a. Représentation des cinq principales bases nucléiques. b. Représentation d’un enchaînement de trois nucléotides dans un brin d’ADN. CHAPITRE 1 Introduction Bibliographique 6 En effet, les travaux présentés ci-après portent sur des structures d’acides nucléiques constitués d’assemblages à quatre brins d’ADN ou d’ARN que l’on appelle des G-quadruplex (G4s). On les appelle ainsi car ces assemblages supramoléculaires se forment grâce aux guanines qui interagissent via des liaisons hydrogènes par leur face Hoogsteen2 (en rose sur la Figure 2a) et non pas Watson-Crick (en violet sur la Figure 2a) pour former ce que l’on appelle un plateau (quartet en anglais) de quatre guanines. On parle aussi de tétrade de guanines. Ces plateaux peuvent se superposer par deux ou par trois par exemple grâce à des interactions de π-stacking entre les surfaces aromatiques des guanines et former un assemblage supramoléculaire (Figure 2b). Au centre de ces structures on retrouve des ions cationiques monovalents, potassium ou sodium, qui stabilisent encore davantage l’ensemble

Rôles des G4s dans le vivant chez l’Homme et les pathogènes non viraux

Dans cette partie nous aborderons les différents rôles attribués aux G4s depuis leur découverte au sein du vivant chez l’Homme et chez les micro-organismes non viraux. La partie II sera tout particulièrement dédiée aux cas des virus.

Chez l’Homme

Les télomères

Les télomères sont des complexes nucléoprotéiques qui contiennent des séquences répétées non codantes d’ADN qui se situent en fin de chromosome. Chez les eucaryotes cette séquence est (TTAGGG)n. Ils servent à la protection de la molécule d’ADN dans la mesure où l’ADN polymérase, responsable de la synthèse d’une nouvelle molécule d’ADN lors de la division cellulaire, est incapable de copier la fin de la séquence dupliquée. Ce sont donc les télomères situés en fin de chromosome qui diminuent à chaque réplication cellulaire et non pas les régions codantes, pour éviter une perte de l’information génétique et donc la mort cellulaire. Une cellule humaine en culture in vitro peut se diviser en moyenne 50 fois avant d’entrer en phase de sénescence . Ce nombre de division limite est appelé limite de Hayflick et est directement corrélé à la longueur des télomères. Nous l’avons abordé plus haut, les séquences télomériques sont des séquences riches en guanine qui peuvent former des G4s . La capacité des régions télomériques à former des G4s est hautement conservée dans le vivant ce qui suggère un rôle participatif de ces structures au bon fonctionnement des télomères . Leur extrémité, qui est linéaire et monobrin du fait de la réplication incomplète des chromosomes, peut se structurer de sorte à recouvrir l’extrémité du télomère. On appelle cette structure le G-overhang Figure 429). Cette structure particulière joue un rôle protecteur des télomères en permettant la formation de la T-loop (Telomere Loop) en fin de séquence télomérique . Cette boucle protège le télomère de la dégradation par les enzymes de réparation de l’ADN qui pourrait confondre la terminaison simple brin avec une cassure de l’ADN. Elle se forme par insertion de la portion simple brin du télomère dans la boucle de réplication, la D-loop . L’extrémité simple brin sert également de substrat à la télomérase. La télomérase est une ADN polymérase ARN dépendante. Elle est composée de deux sous-unités, une sous-unité à activité polymérase que l’on appelle la sous-unité TERT (TElomerase Reverse Transcriptase) et une sous-unité portant le motif ARN qui sert de template à la synthèse de l’ADN télomérique. Son rôle est d’allonger les séquences télomériques pour pallier leur raccourcissement. Son activité est généralement très faible dans les cellules somatiques dans lesquelles la région codant pour la sous-unité TERT est placée sous haute régulation transcriptionnelle . La télomérase est inhibée par les G4s. En effet, elle doit trouver l’extrémité 3’-OH du chromosome pour commencer à polymériser l’ADN. Si cette extrémité est masquée de par le repliement en G4 du simple-brin télomérique, elle ne sera pas accessible et l’allongement du télomère n’aura pas lieu. Par contre, il est intéressant de constater que des G4s peuvent avoir aussi un effet positif sur la télomérase . Le repliement en G4 du brin d’ADN neosynthétisé au sein du complexe de la télomérase active joue un rôle positif sur son efficacité à polymériser.

Table des matières

Introduction Bibliographique
INTRODUCTION
REFERENCES DE L’INTRODUCTION
CHAPITRE 1
I. Les G-quadruplex d’acides nucléiques
I. 1. Généralités
I. 1. i. Définition
I. 1. ii. Topologie des G4s
I. 1. iii. Dispersion des G4s dans le génome
I. 2. Rôles des G4s dans le vivant chez l’Homme et les pathogènes non viraux
I. 2. i. Chez l’Homme
I. 2. ii. Rôles des G4s chez les micro-organismes non viraux
I. 3. Intérêt thérapeutique des G4s
I. 3. i. Dans le traitement des cancers
I. 3. ii. Les G4s comme aptamères
I. 3. iii. Les G4 comme transporteurs
I. 3. iv. Les G4s comme cibles d’antibiotiques ou agents antimicrobiens
II. Rôles et intérêt thérapeutique des G4s chez les virus
II. 1. Rôles des G4s chez les virus
II. 1. i. Cycle viral
II. 1. ii. Les G4s et le phénomène de latence
II. 2. Intérêt thérapeutique des G4s
III. Ligands de structures G quadruplex
III. 2. Les dérivés du pérylène et du naphtalène
III. 3. Les dérivés bisquinolinium
III. 3. i. La pyridostatine
III. 3. ii. Les phenanthrolines
IV. Méthodes pour l’étude des interactions ligand /G4
IV. 1. Méthodes structurales
IV. 1. i. La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
Introduction Bibliographique
IV. 1. ii. La diffraction aux rayons X (RX)
IV. 2. Méthodes indirectes
IV. 2. i. Le Dichroïsme Circulaire (CD)
IV. 2. ii. Förster Energy Transfert (FRET)
IV. 2. iii. Fluorescence Intercalator Displacement (FID)
IV. 2. iv. La chromatographie d’affinité
IV. 2. v. La spectroscopie UV-visible
IV. 3. Méthodes quantitatives
IV. 3. i. La Résonance Plasmonique de Surface (SPR)
IV. 3. ii. La Titration Calométrique Isotherme (ITC)
IV. 3. iii. La spectrométrie de masse
IV. 4. Méthode enzymatique : l’inhibition de la télomérase
V. Les porphyrines
V. 1. Les porphyrines chez l’Homme
V. 1. i. L’hémoglobine
V. 1. ii. Les protéines héminiques
V. 2. Les porphyrines en tant que molécules thérapeutiques
V. 2. i. Usages des porphyrines en tant que molécules anticancéreuses
V. 2. ii. Porphyrines antivirales
V. 3. Les porphyrines comme ligand de G4s
V. 4. Les travaux antérieurs du groupe
V. 4. i. Les porphyrines cationiques
V. 4. ii. Les résultats biologiques
RÉFÉRENCES DU CHAPITRE 1
CHAPITRE 2
I. Introduction
II. Principes généraux de synthèse des porphyrines
II. 1. Méthode dite « mixed aldehydes » et mécanisme
II. 2. Purification des porphyrines
III. Synthèse des porphyrines
Introduction Bibliographique
III. 1. Stratégie de départ
III. 1. i. La porphyrine 5-(4-bromophenyl)-10,15,20-tris[4-(pyridin-2-yl)phenyl]porphyrin 4
III. 1. ii. Mise au point des conditions du couplage de Suzuki-Miyaura
III. 1. iii. Mise en place des conditions d’alkylation
III. 2. Stratégies potentielles
III. 2. i. Le couplage de Buchwald-Hartwig
III. 2. ii. La synthèse d’aldéhydes fonctionnalisés
III. 2. iii. Le retour au couplage de Suzuki-Miyaura mais en conditions aqueuses
III. 3. Stratégie finale
III. 3. i. Synthèse du précurseur fonctionnalisé par un bras COOH : Au(MA)3COOH
III. 3. ii. Synthèse du composé biotinylé : Au(MA)3biotine
IV. Etude de la relation structure/affinité pour les G4s à l’aide d’une série de porphyrines
IV. 1. Les porphyrines synthétisées
IV. 1. i. La porphyrine Au(MA)2Br2
IV. 1. ii. La porphyrine Au(MA)3Br
IV. 1. iii. La porphyrine Au(MA4)4
IV. 1. iv. La porphyrine Au(MA)3MA4
IV. 2. Méthylation des groupements pyridines
IV. 3. Métallation
V. Relation structure/affinité pour les G4s : tests de FRET melting
V. 1. Principe du FRET melting
V. 2. Résultats des tests de FRET melting
V. 2. i. FRET sur l’oligonucléotide F21T
V. 2. ii. Essais de compétitions entre l’ADN G-quadruplex F21T et l’ADN duplex
VI. Conclusion du chapitre
REFERENCES DU CHAPITRE 2
CHAPITRE 3
I. Les méthodes de calcul de l’énergie libre de liaison
I. 1. Les fonctions de score
I. 2. Les méthodes basées sur les calculs de dynamique moléculaire
Introduction Bibliographique
II. Conception d’un cycle thermodynamique permettant de calculer l’énergie libre absolue de liaison
II. 1. Les contraintes de position
II. 2. Mise en place des états intermédiaires
II. 3. Les porphyrines d’or(III)
II. 3. i. Validation de la méthode
II. 3. ii. Résultats
III. La modélisation de nouvelles porphyrines vers la synthèse de meilleurs dérivés
III. 1. Modélisation de nouvelles porphyrines
III. 1. i. Les porphyrines fluorées
III. 1. ii. Des composés aux 2-pyridinium substitués
III. 2. Les essais de synthèses
III. 2. i. La porphyrine « Fenyl »
III. 2. ii. La porphyrine « Fyrrole »
III. 2. iii. La porphyrine « PGF »
III. 2. iv. La rétrosynthèse prope de AuMA NpNO2
IV. Conclusion du chapitre
RÉFÉRENCES DU CHAPITRE 3
MATERIEL ET MÉTHODES
I. Matériels et produits
II. Expériences de FRET
III. Spectroscopie UV-Vis
IV. Synthèse des composés
V. Modélisation Moléculaire
REFERENCES DE LA PARTIE MATERIEL & METHODES
CONCLUSION