L’hémolyse au cours du paludisme

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Diagnostic Biologique

Diagnostic direct :

 Prélèvements
Le prélèvement nécessite une petite quantité de sang qui peut se faire à différents niveaux :
– A la pulpe du doigt
– Au lobule de l’oreille
– Au talon ou au gros orteil (chez les nouveaux – nés)
– Prélèvement veineux
 Goutte épaisse
Technique de réalisation
Deux microlitres de sang sont déposés au milieu d’une lame de verre. A l’aide du coin d’une seconde lame, on exécute un mouvement en spirale durant 2 minutes afin de favoriser la défibrination et d’obtenir un disque homogène de 5 mm de diamètre environ.
La goutte épaisse est ensuite séchée à la température ambiante pendant 30 minutes à 4 heures. On procède ensuite à la déshémoglobinisation de la goutte. Pour cela couvrir la lame d’eau distillée, attendre quelques minutes. Puis la goutte est colorée à l’aide d’une solution de Giemsa diluée à 10% pendant 3 à 5 minutes ou 3% pendant 30 minutes.
Coloration au Giemsa
Principe : On distingue plusieurs types de coloration. La coloration au giemsa par dénaturation enzymatique par la trypsine met en évidence des bandes dites bandes G. La coloration par dénaturation thermique à 87 °C (ou RHG banding, pour Reverse banding using Heat and Giemsa) colore des bandes dites « bandes R ». Cette coloration permet d’identifier sur les frottis sanguins le parasite du paludisme dont l’espèce Plasmodium falciparum.
 Préparer dans une éprouvette graduée la solution de Giemsa diluée à 10% (Mettre dans une éprouvette de 100ml, 10ml de Giemsa pur et compléter à 100ml avec l’eau)
 Recouvrir entièrement la lame avec cette solution diluée de Giemsa.
 Laisser agir pendant 3 à 5 mns.
 Verser la solution de Giemsa.
 Laver modérément à l’eau.
 Sécher verticalement sur un râtelier ou avec un sèche cheveux.
Lecture de la goutte épaisse
Faire la mise au point avec les objectifs 10X et 40X.
Mettre une goutte d’huile sur la préparation et observer à l’objectif 100X.
Examiner 100 champs microscopiques :
– S’il n’y a aucun parasite, la GE sera déclarée négative,
– Mais dès qu’un parasite est vu, il faut commencer le comptage,
– Utiliser 2 compteurs : un pour les parasites et un autre pour les leucocytes,
– Dés que l’on atteint 200 leucocytes, on arrête le comptage de ceux-ci.
Densité Parasitaire (parasites /µl de sang) = nombre de parasites comptés x 8000 / nombre de leucocytes comptés
 Frottis sanguin
Technique de réalisation
Deux microlitres de sang sont déposés sur une lame de verre. Une seconde lame de verre est posée à environ 45° sur la première lame au niveau de la goutte de sang. Le sang doit diffuser le long du bord de la lame. Puis il est étalé par un geste rapide vers l’extrémité de la première lame.
Le frottis doit ensuite être séché rapidement afin de ne pas altérer les hématies qui doivent être jointives sans se chevaucher. Il est ensuite fixé à l’alcool méthylique quelques secondes.
Une fois sec, l’étalement peut être coloré ou conservé quelques jours à l’abri des mouches et de la poussière après fixation au méthanol.
Technique de coloration (voir pour la goutte épaisse)
Lecture du frottis sanguin
La lecture du frottis sera ensuite réalisée au microscope optique au grossissement 100X.
L’examen du frottis sanguin, va permettre d’identifier l’espèce parasitaire en cause.
Choisir la queue où les globules rouges (GR) sont mieux étalés et non superposés.
Identification de l’espèce (Voir morphologie)
Elle se fait en fonction de la ou des formes présentent sur la lame.
 Q. B. C. test
Le sang recueilli sur un tube à hématocrite contenant l’acridine orange, est centrifugé à 1200 tours par minute pendant 5 minutes, puis l’identification est faite par lecture au microscope à fluorescence.
 Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)
Elle repose sur la recherche de l’ADN parasitaire par amplification du matériel génétique.
Cependant son coût élevé limite sa diffusion pour un diagnostic de routine.

Diagnostic indirect

 Tests de Diagnostic Rapide (TDR)
Il s’agit de cassettes de détection prêtes à l’emploi qui permettent en quelques minutes et sans matériel particulier de mettre en évidence la présence de Plasmodium.
C’est une méthode immuno-chromatographique qui utilise des anticorps monoclonaux fixés sur des bandelettes de nitrocellulose dirigés contre les antigènes ou les enzymes du Plasmodium (comme HRP-2 ou Histidin Rich Protein 2, aldolase ou pLDH).
Le diagnostic est positif quand on a la présence de deux bandes au niveau de la cassette.

Méthodologie

Objectif Général

Mesurer l’impact du paludisme à P.falciparum sur quelques paramètres hématologiques et biochimiques.

Objectifs spécifiques

• Evaluer le taux d’hémoglobine et de plaquettes au cours du paludisme à Pf à J0 et J7
• Evaluer les variations biologiques au niveau hépatique et rénal dues à Pf à J0 et J7
• Mesurer les effets des médicaments (CTA) sur les paramètres biologiques.

Description de l’étude

Depuis 2006, le Sénégal a changé sa politique de prise en charge des cas de paludisme simple. La chloroquine, qui était le médicament de première intention pendant plusieurs décennies a été remplacée par une association à base de dérivés d’artémisinine (CTA).
Notre étude entre dans cette optique, il s’agit d’une étude randomisée où les patients étaient traités en fonction du bras dans lequel ils étaient par : l’ASAQ, l’AL ou la DHA-PQ. Elle était aussi prospective et effectuée sur des patients se présentant à la structure sanitaire avec un accès palustre simple confirmé.
Des prélèvements sont effectués sur les patients à J0, c’est-à-dire avant l’administration de médicament et à J7 après traitement antipaludique.
Les patients positifs au paludisme à P.falciparum sont traités par des CTA (ASAQ, AL ou DHA-PQ) conformément aux recommandations du programme national de lutte contre le paludisme (PNLP).

Cadre d’étude

Les patients ont été recrutés au niveau du poste de santé de Deggo, district sanitaire de Pikine et les analyses ont été effectuées à l’hôpital Roi Baudoin de la ville de Guédiawaye située au Nord-Est de Dakar où le service de parasitologie dispose d’un laboratoire.

Période d’étude

L’étude s’est déroulée du mois de novembre à celui de décembre 2012.

Population d’étude

Toute personne fébrile de plus de 6 mois présentant une infestation par P. falciparum non compliquée, confirmée, venant en consultation à l’hôpital considéré.
Ces personnes sont incluses tenant compte de certains critères :
– Critères d’inclusion :
• âge supérieur à 6 mois ;
• infestation monospécifique par P. falciparum détectée par examen microscopique ;
• parasitémie comprise entre 1000 et 100 000 parasites/μl (formes parasitaires asexuées) ;
• température axillaire ≥37,5°C;
• Consentement éclairé.
– Critères de non inclusion :
• présence de signes généraux de danger chez les enfants de moins de cinq ans ou de signes de paludisme à P. falciparum grave selon les définitions de l’OMS (appendice 1) ;
• infestation mixte ou infestation monospécifique par une autre espèce de Plasmodium, détectée par examen microscopique ;
• état fébrile dû à des maladies autres que le paludisme (par exemple rougeole, infection aiguë des voies respiratoires basses, maladie diarrhéique grave avec déshydratation) ou à d’autres maladies sous-jacentes chroniques ou graves connues (par exemple maladie cardiaque, rénale ou hépatique, VIH/sida) ;
• prise antérieure de médicaments, qui risquerait d’interférer avec la pharmacocinétique des antipaludiques utilisés ou modifier les marqueurs biologiques étudiés.

Déroulement de l’étude

Les prélèvements de sang ont été faits par ponction veineuse. Nous avons recueillis chez chaque patient environ 5ml de sang dans un tube EDTA (Ethylène Diamine Tétra Acétique) pour la détermination des paramètres de la NFS. Quelques gouttes du sang de ce tube seront utilisées pour la réalisation du frottis sanguin et de la goutte épaisse (colorée au MGG). La même quantité de sang a été prélevée dans un tube sec pour étudier les paramètres biochimiques.

Matériel et réactifs

Prélèvements

Pour effectués nos prélèvements nous avons utilisé le matériel suivant :
 Alcool à 70°
 Coton hydrophile
 Garrot
 Tube EDTA, Tube sec
 Aiguille simple
 Vacutainer
 Gants
 Portoir
 Poubelle
 Papier absorbant

Goutte épaisse et frottis sanguin

Le matériel nécessaire à la confection de la goutte épaisse était constitué par :
 Lames porte-objets dégraissées et sèches
 Colorants May-Grünwald pur
 Colorant Giemsa à 10%
 Eprouvette de 25 cc ou 100cc
 Pipette pasteur
 Bac à coloration
 Sèche cheveux
 Huile à immersion
 Microscope optique
 Eau minérale
 Compteur manuel
 Calculatrice
 Méthanol

Numération des cellules du sang

Nous avons utilisé un automate le Sysmex XS 1000i, des laboratoires Sysmex.

Détermination des paramètres biochimiques

L’automate A15 des laboratoires biosystems a été utilisé pour la détermination des paramètres biochimiques.

Méthodes

Prélèvements

Deux tubes de sang ont été prélevés par ponction veineuse chez chaque patient : un tube EDTA pour la détermination de la NFS (Sysmex XS 1000i) et un tube sec pour les paramètres biochimiques (A15, biosystems). Quelques gouttes de sang sont utilisées à partir du tube EDTA pour la réalisation du frottis sanguin et de la goutte épaisse (colorée au MGG).

Technique

Numération des globules rouge, des globules blancs et des plaquettes

Elle est effectuée par un automate qui est le Sysmex XS 1000i, des laboratoires Sysmex.
Le Sysmex XS 1000i fonctionne selon le principe de la variation d’impédance.
Le diagnostic de l’anémie sera posé selon les critères de l’OMS (Nutritional anemias, WHO 1968) définissant l’anémie en fonction de l’âge et du sexe à partir du taux d’hémoglobine (Hb) comme suit:
 Hb < 11,0 g/dl enfants âgés 5ans et moins
 Hb < 11,5 g/dl enfants âgés de 6 à 11 ans
 Hb < 12 g/dl adolescents âgés de 12 à 14 ans
 Hb < 12 g/dl femme, Hb < 11,0 g/dl femme enceinte
 Hb < 13 g/dl homme
La thrombopénie ou baisse du taux de plaquettes circulants est définie sur le plan biologique par un taux de plaquettes inférieur à 150000/mm³ (soit 150G/L).
Principe : Les globules rouges et les plaquettes sont dénombrés dans un canal spécifique en utilisant les méthodes de détection de l’impédance ou du courant continu groupé à la focalisation hydrodynamique.
La Focalisation Hydrodynamique (la Détection à Courant Continu) est une technique qui utilise la fluorescence. Elle permet aux analyseurs de classer de façon constante des populations normales de globules blancs (WBC), de globules rouges (RBC) et de plaquettes (PLT) par rapport à des populations anormales, diminuant ainsi le nombre d’interventions manuelles.
Les problèmes de numération cellulaire, tels que la coïncidence ou la recirculation, sont éludés et les discriminateurs automatiques séparent les deux populations cellulaires. Qu’il s’agisse d’échantillons avec des concentrations extrêmement faibles ou extrêmement élevées, le système analyse sans compromis les globules rouges et les plaquettes de façon précise et exacte.

Table des matières

Introduction
I Le paludisme
1-Définition
2-Morphologie
3-Biologie du paludisme
4-Physiopathologie
4.1-L’anémie palustre
4.2-L’hémolyse au cours du paludisme
4.3- La thrombopénie au cours du paludisme
4.4- L’atteinte hépatique au cours du paludisme
4.5- L’atteinte rénale au cours du paludisme
4.6-Effets secondaires biologiques des médicaments antipaludiques
5-Clinique
6- Formes étiologiques du paludisme
II Diagnostic Biologique
1.1- Diagnostic direct :
 Prélèvements
 Goutte épaisse
 Frottis sanguin
 Q. B. C. test
 Polymerase Chain Reaction (P.C.R.)
1.2- Diagnostic indirect
 Tests de Diagnostic Rapide (TDR)
III Méthodologie
1 -Objectif Général
2- Objectifs spécifiques
3 -Description de l’étude
4 -Cadre d’étude
5 -Période d’étude
6 -Population d’étude
7-Déroulement de l’étude
8 -Paramètres étudiés
A Matériel et réactifs
1 -Prélèvements
2 -Goutte épaisse et frottis sanguin
3 -Numération des cellules du sang
4 -Détermination des paramètres biochimiques
B Méthode
1-Prélèvements
2-Méthode
2.1- Numération des globules rouge et des plaquettes
2 .2- Paramètres biochimique
IV- Résultats
V Discussion
Conclusions