Les techniques d’extraction de l’ADN libre circulant

Les techniques d’extraction de l’ADN libre circulant

Extraction ADN libre circulant

La prise en charge des patients atteints d’un cancer au stade métastatique passe aujourd’hui par une caractérisation des altérations somatiques tumorales à la recherche d’une cible thérapeutique potentielle. L’isolement et l’analyse de l’ADN tumoral circulant issu de plasma est susceptible d’être utilisé comme approche non invasive pour détecter ces altérations. Mais les résultats analytiques sont très dépendants de l’étape d’extraction qui doit permettre d’isoler efficacement des quantités souvent faibles de matériel et être compatible avec les techniques mises en place en aval. Ces méthodes d’extraction doivent également pouvoir être mises en place facilement à l’hôpital dans le cadre du soin courant.

Différentes méthodes d’extraction

Technologie : colonne avec membrane de silice La technologie d’extraction sur colonne avec membrane de silice est une méthode largement répandue dans les kits d’extraction de laboratoire. L’ADN est adsorbé spécifiquement sur la membrane de silice en présence de certains sels et à un pH particulier. Les contaminants cellulaires sont éliminés par les différentes étapes de lavage. Des sels chaotropes sont inclus pour aider à la dénaturation de protéines et à l’extraction de l’ADN. L’ADN est finalement élué dans un tampon faible en sel ou tampon d’élution. Depuis quelques années, nous utilisons au laboratoire le kit de la société Qiagen : QIAamp® Circulating Nucleic Acid kit, qui fonctionne sur ce principe. Il permet de récupérer des acides nucléiques fragmentés présents dans un volume de plasma allant de 1 à 5mL. Il faut 4 heures pour extraire 24 échantillons. Il est devenu notre kit de référence. C’est aussi le kit le plus référencé dans les publications concernant l’ADNtc. Ies techniques d’extraction de l’ADN libre circulant

 Technologie : séparation bille magnétique

La technologie d’extraction sur billes magnétique est une méthode basée sur la liaison réversible de l’ADN à une surface solide, des billes paramagnétiques recouvertes d’une couche de silice. Après liaison spécifique de l’ADN, les billes sont séparées des autres composants cellulaires contaminants, lavées et finalement l’ADN purifié est élué. Les billes magnétiques lient l’ADN de manière plus efficace que les membranes de silice, ce qui entraîne des rendements supérieurs et plus uniformes. En outre, il n’y a pas de risque de colmatage de la membrane au cours du processus d’extraction. Ce problème de colmatage est particulièrement préoccupant avec des échantillons riches en protéines de grand volume tels que le plasma. Les automates QIAsymphony® SP de la société Qiagen et Maxwell® RSC de la société Promega fonctionnent sur ce principe, de même que le kit manuel MagMAX™.

 QIAsymphony® SP

DSP Virus Pathogen Qiagen a adapté son protocole manuel pour le mettre en place sur l’automate QIAsymphony® SP. A la différence du kit manuel, la capture des ADNlc ne se fait pas sur une membrane à base de silice mais sur des particules magnétiques à base de silice. Le pH des tampons de lavage et d’élution font que l’ADN reste fixé ou non aux billes. Comme pour le kit manuel, le protocole comporte 4 étapes : une lyse, un accrochage de l’ADN sur les billes, des lavages et une élution (Figure 20). Il peut traiter 24 échantillons en parallèle. De même, l’utilisation d’un RNA carrier est fortement recommandée si on veut optimiser la récupération des acides nucléiques. Une extraction complète dure 3h00. Le protocole est optimisé pour des grands volumes de plasma de l’ordre de 4mL avec une élution dans 70µL de tampon. Mais dans le cadre de notre étude nous avons décidé de tester ce kit dans les mêmes conditions que celles utilisées avec la technique manuelle Qiagen, c’est à dire à partir de 2mL de plasma et une élution dans 40µL de tampon.