POTENTIALITES NUTRITIONNELLES DES FEUILLES DE Salvadora angustifolia Turill (Sasavy) CONSOMMEES PAR LES FEMMES ALLAITANTES

MATERIELS ET METHODES

ECHANTILLONAGE

Les feuilles ont été récoltées à Tanambao, sous préfecture de Morondava, le 15 Septembre 2004, matin. Elles sont cueillies avec leur tige et conditionnées dans un sac de couleur opaque en plastique pendant le transport.
A l’arrivée au laboratoire, les feuilles fraîches de bonne qualité ont été séparées des impuretés et des tiges.

PREPARATION DES PRISES D’ESSAI

PREPARATION DES EXTRAITS BRUTS

EXTRAIT BRUT CRU
100g de feuilles fraîches sont broyées avec 300ml d’eau distillée à l’aide d’un broyeur Moulineur Turbo Blinder. Le mélange est homogénéisé dans un bain de glace sous agitation continue, durant une heure, puis macéré pendant une nuit à 4°C. Le macérât est filtré, puis centrifugé à 16 000g pendant 30 min à cette même température. Le surnageant constitue l’extrait brut. Il est conservé au congélateur pour les analyses ultérieures.
EXTRAIT BRUT CUIT
30g de feuilles sont introduits avec 700ml d’eau distillée dans un erlen. La préparation est portée à ébullition, jusqu’à ce que la couleur devient jaune (60 min environ). Le jus est récupéré et réservé pour la préparation de l’extrait brut (solution limpide).
La décoction de Sasavy obtenue est traitée comme décrit au paragraphe a) et l’extrait est ensuite conservé au congélateur pour les analyses ultérieures.

LYOPHILISATION (Préparation de la poudre de jus)

Principe
La lyophilisation est un procédé de dessiccation qui consiste à congeler un produit à basse température (moins de 70°C) puis à le mettre sous vide en remontant lentement l’eau de l’état de glace à l’état de vapeur (sublimation). Elle conserve les propriétés des aliments [78].
Mode opératoire
35g de feuilles fraîches sont utilisés pour la préparation de 700ml de jus. Il est réparti en faible épaisseur dans 3 erlens de 500ml. Le tout est congelé à moins 70°C pendant 24 heures avant d’être placé au lyophilisateur. La lyophilisation est terminée au bout de 24 heures.

MESURE DU pH, DE LA TURBIDITE ET DE LA DENSITE

MESURE DU pH

Les milieux biologiques sont généralement des mélanges complexes contenant en particulier de nombreux composés à caractère acide et à caractère alcalin. Le pH traduit l’acidité actuelle d’un milieu, c’est à dire la concentration en ion H+.
Les pH de la décoction, de l’extrait brut cru et cuit sont mesurés à l’aide d’un pH-mètre.

MESURE DE LA TURBIDITE

L’intensité d’un faisceau lumineux traversant une suspension de particules est diminuée par suite de la diffusion due à ces particules. Le turbidimètre est utilisé pour qualifier l’aspect de la décoction et des extraits bruts. Pour ce faire, un volume déterminé d’échantillon est introduit dans le turbidimètre. La mesure de la turbidité est figurée sur un écran lié à l’appareil.

MESURE DE LA DENSITE

C’est le rapport de la masse d’un certain volume d’un corps à celle du même volume d’eau. La densité est mesurée en introduisant un densimètre dans la solution à étudier (extraits bruts et jus de la décoction).

DETERMINATION DE L’ HUMIDITE

Principe
L’humidité est définie par la quantité perdue par la substance lorsqu’on l’amène en équilibre vrai avec une pression de vapeur d’eau nulle (HR=O%) dans des conditions telles que des réactions perturbatrices éventuelles soient évitées [39, 47, 59].
Mode opératoire
5g d’échantillon (feuilles fraîches) sont mis dans une capsule thermorésistante, puis séchés à 103 ±2°C durant 8 heures. L’opération est répétée jusqu’à l’obtention d’une masse pratiquement constante. Avec H% = teneur en eau pour 100g d’échantillon
M = masse de la capsule contenant l’échantillon avant séchage (g)
m1 = masse de la capsule contenant l’échantillon après dessiccation (g)
m0 = masse de la capsule vide (g)

DETERMINATION DE LA TENEUR EN MINERAUX

TENEUR EN CENDRES BRUTES

Principe
A haute température (550°C), les substances organiques subissent une combustion complète et se transforment en CO2 et H2O. Les restes constituent les cendres brutes.
Méthode
5g de prise d’essai (feuilles fraîches hachées ou lyophilisat) sont mises dans des capsules de silice. Les préparations sont introduites dans un four à moufle réglé à 550°C durant 6 heures. Après dessiccation les cendres obtenues sont pesées.
C% = teneur en cendres brutes par rapport en matière sèche m0 = masse du résidu après incinération
m1 = masse de la prise d’essai

DOSAGE DES ELEMENTS MINERAUX

DETERMINATION DE LA TENEUR EN Ca, Mg, K et Na
Le dosage au spectrophotomètre d’absorption atomique est adopté pour cette étude. C’est une méthode utilisée pour l’analyse quantitative d’un grand nombre d’éléments chimiques [41].
Principe
A haute température, les atomes des sels minéraux sont libérés des liaisons chimiques en captant de l’énergie. Leur retour à l’état fondamental est marqué par la libération d’énergie correspondante à la quantité d’énergie responsable de leur instabilité atomique. Cette étape est très énergétique et fournit ainsi une radiation de grande intensité appelée : « raie de résonance »
[47]. Cette dernière est spécifique de chaque élément donné. La concentration de cet élément est déterminée par la méthode photométrique obéissant la loi de BEER LAMBERT [7].
A=K×L×C
A = absorbance
L = parcours optique dans le brûleur
K = coefficient d’absorption pour la longueur d’onde choisie
C = concentration de l’élément
Mode opératoire
Préparation de la gamme étalon
Une gamme de concentration de chaque élément à doser est préparée au préalable à partir d’une solution mère de concentration bien définie, puis dosée au spectrophotomètre d’absorption
atomique en utilisant les raies de résonance suivantes : 285,2 nm pour le Mg, 422,7 nm pour le Ca, 589 nm pour le Na et 766,5 nm pour le K.
Dosage des éléments minéraux
0,1g de cendre est additionné de 1ml d’HCl concentré et 2ml d’eau distillée. Le tout est mis sur une plaque chauffante jusqu’à l’apparition de vapeur. La solution obtenue est complétée avec un petit volume d’eau distillée puis filtrée. Le filtrat est récupéré dans une fiole jaugée de 100ml. Le rinçage à plusieurs reprises est nécessaire pour récupérer le maximum d’éléments minéraux. Le volume est ensuite ramené à 100ml avec de l’eau distillée.
La solution de Lanthane 0,2%, qui joue le rôle de tampon spectral, est ajoutée à l’extrait.
Elle élimine toute interférence possible due aux éléments perturbateurs.
La D.O. spécifique de chaque élément est lue au spectrophotomètre d’absorption atomique. La concentration de chaque élément est déduite de la courbe étalon.
DETERMINATION DE LA TENEUR EN PHOSPHORE
Principe
Le phosphore est dosé par la méthode colorimétrique de FISKE et SUBAROW. En présence de molybdate d’ammonium, le phosphore sous forme minérale donne un précipité. Ce dernier est réduit par le métavanadate d’ammonium et il se forme un oxyde bleu de molybdène. L’intensité de la coloration varie en fonction de la concentration de phosphore présent dans le milieu.
Mode opératoire
Préparation de la gamme étalon
A partir de la solution de KH2PO4 à 100µg/ml est préparée une gamme étalon de phosphore de concentration allant de 0 à 50µg/ml. 1ml de chaque solution est additionnée de 1ml de mélange de métavanadate/ molybdate (V/V) et le tout est ramené à 10ml avec l’eau distillée. 100 ml de la solution de métavanadate d’ammonium sont faits de 50ml de HNO3 concentré, de 0,25mg de monovanadate d’ammonium et d’eau distillée. Tandis que 100ml de la solution de molybdate d’ammonium est obtenue par la dissolution de 5mg de heptamolybdate d’ammonium dans 100ml d’eau distillée.
Après 30 minutes de repos à la température ambiante, la D.O. est lue à 420 nm.
Dosage du phosphore
1 ml de filtrat est additionné de 1ml de mélange de métavanadate/molybdate (V/V) et le tout est ramené à 10ml avec l’eau distillée. Après 30 minutes de repos, la D.O. est lue à 420 nm. La concentration de phosphore dans le filtrat est obtenue par extrapolation à partir de la courbe étalon.

DETERMINATION DE LA TENEUR EN MATIERE ORGANIQUE

EXTRACTION DU β- CAROTENE

Principe
Les caroténoïdes sont extraits du produit par un mélange approprié de solvant organique. L’extrait obtenu est concentré sous pression réduite, filtré avant d’être soumis à l’analyse chromatographique en phase liquide. La chromatographie liquide haute performance HPLC est une technique qui permet de doser les substances à l’état de traces.
L’interaction de la substance à analyser avec la phase mobile constituée de solvant et la phase fixe formée par la colonne de silice détermine l’extraction de cette substance.
Méthode
5g d’échantillon, 20ml d’éther de pétrole et 60ml d’isopropanol sont introduits dans une ampoule à décanter. Le mélange est agité pendant une minute.100ml d’éther diéthylique ainsi que 20ml de NaCl sont ajoutés pour améliorer la séparation. Après 3 minutes d’agitation, le mélange est laissé décanté. La phase aqueuse est récupérée dans une autre ampoule à décanter puis extraite de nouveau avec 100ml d’éther de pétrole. Les 2 phases organiques ainsi obtenues sont rassemblées puis lavées 4 fois avec 100ml de NaCl à 10%. Le mélange est ensuite passé à l’évaporateur rotatif afin d’éliminer le solvant. Le résidu obtenu est mis en suspension avec 1ml d’une solution constituée de pyrogallol, d’eau distillée et d’éther diéthylique dans les proportions 2/2/6. La préparation est agitée pendant 2 minutes, puis centrifugée pendant 10 minutes à 3000 tours par minute. Le surnageant formé est mis à sec de nouveau à l’évaporateur rotatif. Le résidu est repris avec l’isooctane. Le tout est mélangé avec la phase mobile qui est composée de 95,5% de triméthylpentane et 1,5% de propanol.
Analyse en HPLC
50µl de β- carotène constituant l’étalon et 50µl d’échantillon sont injectés au niveau de la pompe de la colonne HPLC.
La concentration en β- carotène de l’échantillon est déterminée à partir des surfaces des pics des tracées observées sur un intégrateur calculateur accompagnant la colonne.

DOSAGE DES LIPIDES

Principe
Il s’agit d’extraire l’huile dans l’échantillon par un solvant organique d’une façon continue. La méthode décrite par Wolf est adoptée pour cette étude [59].
Mode opératoire
20g de prise d’essai (feuilles sèches broyées à 10% d’humidité et lyophilisat de la décoction) sont introduits dans une cartouche confectionnée à l’aide d’un papier filtre. Les deux bouts sont bouchés par un tampon de coton. La préparation est ensuite mise dans le corps du soxhlet, adapté sur un ballon contenant environ 300 ml d’hexane et sous un système réfrigérant ascendant. Le tout est porté à 65°C pendant 12 heures. L’extrait est recueilli dans le ballon. Le solvant est éliminé à l’aide d’un évaporateur rotatif à 45°C. Les dernières traces d’hexane sont chassées par séchage à 60°C. Après dessiccation, le ballon est pesé.

DOSAGE DES PROTEINES

LES PROTEINES TOTALES
Principe
La teneur en protéines est déterminée indirectement par la quantité d’azote totale selon la méthode de Kjeldahl [23, 59]. Sous l’action de l’acide sulfurique concentré à chaud, l’azote organique est minéralisé sous forme de sulfate d’ammonium ; l’oxygène et l’hydrogène se dégagent sous forme de CO2 et de H2O. L’ammoniac du minéralisât est déplacé par l’addition de la soude concentrée en excès dans le milieu réactionnel. Le distillat formé par le mélange d’ammoniac libéré et la vapeur d’eau condensée est retenu par un acide faible, puis dosé par titration.
Méthode
0,25g de l’échantillon est placé dans un tube de digestion contenant 8ml de H2SO4 à 98% et 1,4g de catalyseur (CuSO4 / K2SO4). La minéralisation se fait dans un bloc de digestion à 430°C et dure 3 heures environ jusqu’à l’obtention d’une liqueur limpide de coloration vert. Après refroidissement, la liqueur est distillée pendant 5 minutes dans un distillateur BÜCHI 316, en présence de soude concentrée. Cette procédure a pour but de neutraliser les sels d’ammonium et de les déplacer en ammoniac.
Ce distillat est récupéré dans une solution d’acide sulfurique 0,1N préalablement préparée en présence d’un indicateur coloré (réactif de Tashiro). Puis, il est titré avec une solution de NaOH 0,1N dont le volume est noté.
LES PROTEINES SOLUBLES
Principe
Nous adopterons la méthode de LOWRY (1951) pour doser les protéines solubles [52]. Cette méthode utilise le fait que le réactif de FOLIN CIOCALTEU (acide phosphomolybdique et phosphotungstique), mis en présence d’une protéine, réduit en un complexe bleu de molybdène avec les sels de cuivres (réaction de BIURET) [57, 23]. Cette réaction est due aux groupements oxydés des acides aminés constitutifs : principalement des groupements phénoliques du tryptophane et de la tyrosine [24]. L’intensité de la coloration dépend de la composition de la protéine. La lecture est faite à 750 nm.
Mode opératoire
– Préparation des réactifs
Les solutions suivantes sont à préparer au préalable :
Solution A : solution de Na2CO3 à 2% (P/V) dans une solution de NaOH 0,1N.
Solution B : solution de sulfate de cuivre à 1% (P/V) dans l’eau distillée.
Solution C : solution de tartrate double de sodium et de potassium à 2,4%° dans l’eau distillée.
Solution D : préparée temporairement en mélangeant les solutions A/B/C dans les proportions de 100 :1 :1 (V/V/V).
Solution E : réactif de folin Ciocalteu dilué de moitié avec de l’eau distillée.
Solution standard de Sérum Albumine Bovine à 1mg/l.
Eau physiologique : solution de chlorure de sodium 0,9 % (P/V) dans l’eau distillée.
– Préparation d’une gamme étalon
Dans un premier temps, la gamme étalon allant de 0 à 0,5 mg/ml est préparé à partir d’une solution mère (SAB à 1mg/ml).
Ensuite, 0,2 ml de chacune est mélangée avec 1ml de solution D, homogénéisé et laissé au repos pendant 10 minutes à la température ambiante. 0,1ml de réactif de FOLIN CIOCALTEU est ajouté dans la préparation. Le tout est agité de nouveau et mis à l’obscurité pendant 1 heure à la température ambiante.
La D.O. est lue au spectrophotomètre à 750 nm.
– Dosage des protéines solubles
Les extraits bruts de feuilles crues et la décoction sont dilués respectivement par 60 fois et 30 fois dans l’eau physiologique. La suite de l’opération est identique à celle appliquée précédemment.
La concentration en protéine soluble des extraits à doser est déduite par la courbe étalon de SAB.
DETERMINATION DE LA COMPOSITION EN ACIDES AMINES
La détermination de la composition en acides aminés comprend 2 étapes : l’hydrolyse acide et la chromatographie sur couche mince.

INTRODUCTION
Première partie: GENERALITES
I. ALIMENTS, ALIMENTATION, NUTRIMENTS ET BESOINS EN EAU
I.1. ALIMENTATION ET NUTRITION
I.2. ALIMENTS ET NUTRIMENTS
I.2.1. LES MACRONUTRIMENTS
I.2.1.1. LES GLUCIDES
I.2.1.2. LES PROTEINES
I.2.1.3. LES LIPIDES
I.2.2. LES MICRONUTRIMENTS
I.2.2.1. LES ELEMENTS MAJEURS
I.2.2.2. LES ELEMENTS MINEURS
I.2.2.3. LES VITAMINES
II. LES SUBSTANCES ANTI-NUTRITIONNELLES
III. LA MALNUTRITION
IV.LA LACTATION
IV.1. ORIGINE DU LAIT MATERNEL
IV.2. BESOINS EN NUTRIMENTS DES NOURRISSONS ET DES FEMMES ALLAITANTES
VI.3. COMPOSITION EN NUTRIMENTS DU LAIT MATERNEL HUMAIN
VI.4. POUVOIR LACTOGENE DE CERTAINES PLANTES
V. PRESENTATION DU MATERIEL VEGETAL
V.1. SYSTEMATIQUE
V.2. DESCRIPTION
V.3. ECOLOGIE
V.4. LOCALISATION A MADAGASCAR
Deuxième partie: ANALYSE ET DOSAGE DES NUTRIMENTS
I. MATERIELS ET METHODES
I.1 ECHANTILLONAGE
I.2 PREPARATION DES PRISES D’ESSAI
I.2.1. PREPARATION DES EXTRAITS BRUTS
I.2.2. LYOPHILISATION
I.3 MESURE DU pH, DE LA TURBIDITE ET DE LA DENSITE
I.3.1. MESURE DU pH
I.3.2. MESURE DE LA TURBIDITE
I.3.3. MESURE DE LA DENSITE
I.4. DETERMINATION DE L’ HUMIDITE
I.5 DETERMINATION DE LA TENEUR EN MINERAUX
I.5.1. TENEUR EN CENDRES BRUTES
I.5.2. DOSAGE DES ELEMENTS MINERAUX
a) Détermination de la teneur en ca, mg, k et na
c) Détermination de la teneur en phosphore
I.6 DETERMINATION DE LA TENEUR EN MATIERE ORGANIQUE
I.6.1. EXTRACTION DU β- CAROTENE
I.6.2. DOSAGE DES LIPIDES
I.6.3. DOSAGE DES PROTEINES
a) Les protéines totales
b) Les protéines solubles
d) Détermination de la composition en acides aminés
c.1) hydrolyse acide
c.2) chromatographie sur couche mince
I.6.4. DOSAGE DES GLUCIDES
a) Détermination de la teneur en glucides totaux
b) Détermination de la teneur en sucres simples
c) Détermination de la composition en sucres simples
c.1) l’hydrolyse acide :
c.2) chromatographie sur couche mince de cellulose
d) Dosage des fibres
d.1) détermination de la teneur en acide pectique
d.2) dosage des insolubles formiques (Teneur en lignocellulose)
I.6.5. LA VALEUR ENERGETIQUE GLOBALE
I.7. DETERMINATION DE LA PRESENCE DES FACTEURS ANTINUTRITIONNELS
I.7.1. LES ALCALOÏDES
I.7.2. LES SAPONOSIDES
I.7.3. LES TANINS ET LES POLYPHENOLS
I.7.4. LES FLAVONOÏDES ET LES LEUCOANTHOCYANES
I.7.5. LES STEROÏDES ET LES TRITERPENES
I.7.6. LES IRRIDOÏDES
I.8. TEST DE TOXICITE
II. RESULTATS
II.1 CARACTERES ORGANOLEPTIQUES
II.2 HUMIDITE
II.3 TENEUR EN MATIERE SECHE
II.4 LES ELEMENTS MINERAUX
II.4.1 TENEURS EN CENDRES BRUTES
II.4.2 TENEUR EN ELEMENTS MINERAUX
II.5 LES LIPIDES
II.5.1 LES LIPIDES TOTAUX
II.5.2 LES β- CAROTENES
II.6 LES PROTEINES
II.6.1. TENEURS EN PROTEINES TOTALES
II.6.2. TENEURS EN PROTEINES SOLUBLES
II.6.3. LES ACIDES AMINES CONSTITUTIFS
II.7 LES GLUCIDES
II.7.1. TAUX DE GLUCIDES TOTAUX
II.7.2. TENEURS EN SUCRES SIMPLES
II.7.3. COMPOSITION EN SUCRES SIMPLES
II.7.4. LES FIBRES ALIMENTAIRES
II.8 VALEUR ENERGETIQUE GLOBALE
II.9 LES FACTEURS ANTI-NUTRITIONNELS
II.10. LA TOXICITE
III. RECAPITULATION DES RESULTATS
Troisième partie: EFFETS DE LA CONSOMMATION DES FEUILLES
I. MATERIELS ET METHODES
I.1. DEROULEMENT DE L’ENQUÊTE A MORONDAVA
I.2. DEROULEMENT DES TESTS DE CONSOMMATION
II. RESULTATS
II. 1. RESULTATS D’ENQUÊTE
II.1.1. INFORMATIONS ACQUISES
II.1.2. PREPARATION CULINAIRE ET MODE DE CONSOMMATION DE SASAVY
II.1.3 MOTIFS DE LA CONSOMMATION
a) Informations obtenues lors de l’enquête
b) Interprétation
b.1) Effet de Sasavy par rapport à l’énergie apportée par l’alimentation de la mère
b.2) Appréciation de Sasavy par rapport à l’énergie apportée par l’alimentation
II. 2 EXPERIENCE SUR LES FEMMES ALLAITANTES
Quatrième partie: DISCUSSION
I. ANALYSE NUTRITIONNELLE
I.1. CARACTERES ORGANOLEPTIQUES
I.2. HUMIDITE
I.4. VALEUR MINERALE
I.5. VALEUR LIPIDIQUE
I.5.1. LIPIDES TOTAUX
I.5.2. VALEUR VITAMINIQUE
I.6. VALEUR PROTEIQUE
I.6.1 PROTEINES TOTALES
I.6.2 ACIDES AMINES INDISPENSABLES
I.7. VALEUR GLUCIDIQUE
I.8. VALEUR ENERGETIQUE
I.9. LES SUBSTANCES ANTI NUTRITIONNELLES
II. EFFET DE LA CONSOMMATION DES FEUILLES DE SASAVY
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
ANNEXES