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Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus est un pathogène humain majeur qui a été mis en évidence en 1881 par Alexander Ogston. Après une analyse microscopique d’infections purulentes, Ogston a découvert des bactéries rondes, groupées en forme de grappes de raisin d’où l’association des termes grecs staphyle, grappe de raisin et kokkos, grain. Il est maintenant établit que S. aureus est une bactérie Gram-positive, aéro-anaérobie facultative qui produit une catalase et une coagulase, et qui peut tolérer une activité en eau très réduite (Aw= 0,83). Dans des conditions optimales, la division cellulaire se produit approximativement tous les 20 min avec un diamètre de cellule allant de 0,5 à 1,5 μm. S. aureus est capable de croître sur une large gamme de milieux de culture, sélectifs (p. ex. les géloses Chapman, et Baird Parker), ou non sélectifs (p. ex. un milieu gélosé enrichi en sang, une gélose nutritive, ou une gélose cœur-cervelle). Sur une gélose au sang, les souches «typiques» de S. aureus donnent des colonies lisses, convexes avec des diamètres de 1~3 mm, de couleur jaune dorée due aux caroténoïdes, et sont souvent hémolytiques (𝛼𝛼-hémolysine) .
Portage de Staphylococcus aureus
S. aureus est défini comme un commensal humain normal ayant le potentiel de provoquer des infections opportunistes. La niche écologique primaire de cette espèce étant les fosses nasales antérieures ou vestibulum nasi . D’après des études, on distingue trois modèles de portage nasal de S. aureus chez les individus sains : porteurs persistants, porteurs intermittents et non-porteurs. D’autres études montrent que près de 20% (de 10 à 35%) des individus sont porteurs persistants, environ 30% sont porteurs intermittents (de 20 à 75%), et environ 50% (de 16 à 69%) sont non-porteurs .
Les enfants ont des taux plus élevés de portage persistant que les adultes . En effet, les taux varient considérablement avec l’âge, passant d’environ 45% durant les 8 premières semaines à 21% en six mois . Plus de 70% des nouveau-nés ont au moins une culture positive nasale avec S. aureus . Les études montrent que la transition du portage persistant au portage intermittent ou non portage se produit durant l’adolescence.
En conséquence, les prélèvements à la recherche d’un portage doivent comprendre les fosses nasales. Cependant, plusieurs travaux suggèrent que d’autres sites de portage sont possibles en absence de portage nasal :
Selon Acton et al., 2009, l’espèce bactérienne S. aureus, y compris le SARM, trouve sa niche écologique dans le nez humain, mais est également capable de coloniser les intestins et la région péritonéale . Après avoir effectué un dépistage multi sites (nez et gorge) chez 2966 individus pour le portage de S. aureus, Mertz et al., 2007, ont trouvé un total de 1100 personnes (37,1%) qui étaient des porteurs nasaux, et 379 personnes (12,8%) qui étaient porteurs de S. auerus uniquement au niveau de la gorge. Le dépistage de gorge augmente significativement la sensibilité de détection des porteurs de S. aureus de 25,7%.
Infections à Staphylococcus aureus
S aureus est typiquement porté de façon asymptomatique par l’homme et les animaux. Cependant, il est responsable d’une large gamme d’états pathologiques nécessitant un traitement. La nature et l’étendue de la maladie dépendent des caractéristiques de la souche infectante, la susceptibilité de l’hôte et la voie d’entrée. Les infections les plus courantes sont les infections de la peau et des tissus mous (SSTIs pour «Skin and soft tissu Infections») incluant : la folliculite, le furoncle, l’anthrax, l’abcès, la cellulite, l’impétigo, les plaies chirurgicales postopératoires , et les ostéomyélites . Les souches portant des toxines particulières peuvent être associées à des états pathologiques spécifiques, y compris le syndrome staphylococcique de la peau ébouillantée (SSSS pour « Staphylococcal scalded skin syndrome ») , le syndrome du choque toxique (TSS pour «Toxic shock syndrome ») ,la toxi-infection alimentaire , et la pneumonie nécrosante . S. aureus peut aussi provoquer une septécimie ou sepsis, lorsque le flux sanguin est infecté. Entre 1995 et 2002, 20% de septicémie nosocomiales aux États-Unis ont été causés par S. aureus.
Caractéristiques moléculaires du SARM
Gène mecA et cassette chromosomique staphylococcique : La résistance à la méticilline chez les staphylocoques est causée par l’expression de la protéine liant la pénicilline PLP2a codée par le gène mecA localisé dans un élément génétique mobile dit : cassette staphylococcique chromosomique (SCC pour « Staphylococcal Cassette Chromosome ») . SCCmec peut être considéré comme un îlot de résistance aux antibiotiques qui transporte le complexe du gène mecA, codant pour la résistance aux β-lactamines et contient aussi des transposons et des copies de plasmides qui portent divers gènes de résistance à l’encontre d’autres antibiotiques autres que les β-lactamines .
Composition de la SCCmec : Cette cassette est formée de complexe du gène ccr, de complexe du gène mecA, d’une région J dont la variation permet de définir des sous-types de cassettes, (iv) d’une séquence d’insertion IS permettant l’inclusion dans le chromosome . La composition de presque tous les éléments SCCmec de S. aureusidentifiés jusqu’à ce jour peut être présentée comme suit : (orfX) J3-mec-J2-ccr-J1 . L’exception constitue la SCCmecVII et la nouvellement décrite SCCmecIX, avec le complexe du gène ccr positionné entre les régions J3 et J2 et le complexe du gène mec entre les régions J2 et J1 .
Méthodes de détection de la résistance à la méticilline
Il existe une variété de méthodes de laboratoire utilisées pour l’identification de SARM. Le processus peut être indirect où la première étape consiste à déterminer si une colonie suspecte est S. aureus ou pas, suivie d’un test ultérieur de cette colonie de S. aureus pour la susceptibilité à la méticilline. D’autres méthodes impliquent l’utilisation de milieux sélectifs développés pour l’identification présomptive des colonies SARM. Il existe également des méthodes telles que la réaction en chaîne de la polymérase (PCR pour « Polymerase Chain Reaction ») où l’échantillon peut être testé directement pour le SARM.
Identification de l’espèce S. aureus : La présence de S. aureus dans un prélèvement pathologique pourrait d’abord être suspectée après un examen direct à la coloration de Gram et/ou bleu de méthylène . Le micro-organisme est isolé en ensemençant le prélèvement pathologique sur un milieu de culture solide tel que la gélose au sang frais (GSF) ou cuit (GSC), gélose Trypticase soja (TSA) ou la gélose nutritive. Les échantillons susceptibles d’être contaminés par d’autres micro-organismes peuvent être ensemencés sur la gélose Chapman, ce qui permet aux staphylocoques qui sont halotolérantes de pousser. Idéalement, une coloration de Gram d’une colonie doit être effectuée, ainsi que les tests catalase et coagulase. Le test catalase consiste a utilisé le peroxyde d’hydrogène (H2O2) pour différencier les staphylocoques des streptocoques qui sont catalase négative. La présence de catalase se caractérise par la formation immédiate de bulles d’oxygènes . Le test coagulase qui met en évidence l’aptitude des bactéries à coaguler le plasma est le principal test caractérisant S. aureus en médecine humaine. En médecine vétérinaire, d’autres espèces du genre Staphylococcus peuvent avoir une réaction positive telles que S. intermedius .
Un autre test utile pour identifier S. aureus est la production de la désoxyribonucléase thermostable ayant des propriétés endo- et exonucléasiques. S. aureus peut être aussi confirmé par des techniques immunologiques en utilisant des particules de latex sensibilisées avec des IgG et du fibrinogène qui lient la protéine A et le facteur agglutinant, respectivement, sur la surface de la cellule bactérienne. Ceux-là sont disponibles dans des kits commerciaux tels que Staphaurex ou Pastaurex .
L’identification de S. aureus peut aussi être réalisée à l’aide de galeries biochimiques d’identification miniaturisées, les galeries API (API STAPH et ID 32 STAPH). Ces systèmes utilisent des tests d’acidification ou d’assimilation des sucres et des tests enzymatiques . Outre les 2 galeries API, il existe autres systèmes automatisés.
Spectrométrie de masse de type MALDI-TOF : L’identification des micro-organismes cliniquement importants est l’une des tâches-clés du laboratoire de microbiologie. Jusqu’à présent, la technique standard restait encore toujours basée sur les galeries ‘multicolores’ développées par Pasteur et Koch. L’introduction récente de la spectrométrie de masse MALDI-TOF dans les laboratoires de bactériologie médicale a profondément bouleversé la manière d’identifier les micro-organismes isolés d’échantillons biologiques et environnementaux.
La spectrométrie de masse MALDI-TOF repose sur une technique d’ionisation, mise au point dans les années 80 , et conduisant à l’identification des bactéries par l’analyse de leurs protéines totales (protéines ribosomales et protéines associées aux membranes), il s’agit d’une désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI ) .
Le principal avantage de cette technique est le gain de temps significatif pour l’identification des bactéries puisqu’il suffit de quelques minutes à partir du prélèvement d’une colonie isolée sur un milieu de culture solide pour obtenir une identification sécurisée au niveau de l’espèce, là où vingt-quatre heures supplémentaires sont nécessaires avec les techniques d’identification phénotypiques. De plus, le spectromètre permet un diagnostic d’urgence, notamment en période de garde et l’analyse rapide des flores polymicrobiennes avec mise en route des antibiogrammes adaptés. Autre avantage de taille en faveur de l’utilisation de la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour l’identification des micro-organismes : le coût. C’est une technique ne nécessitant presque pas de matériel de consommation, ce qui est important après un investissement initial important .
Parallèlement à son utilisation en routine pour l’identification des microorganismes, la détection de mécanismes de résistance aux antibiotiques représente un intérêt particulier. Quelques études ont montré la capacité de la spectrométrie de masse MALDI-TOF à distinguer les SARM des SASM.
Table des matières
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION
CHAPITRE 2 : REVUE DE LITTERATURE
1. Staphylococcus aureus
1.1. Caractéristiques générales
1.2. Portage de Staphylococcus aureus
1.3. Infections à Staphylococcus aureus
1.4. Facteurs de virulence et physiopathologie
1.4.1. Facteurs intervenant dans la colonisation, l’adhésion, l’invasion, la diffusion
1.4.1.1. La protéine A
1.4.1.2. La protéine de liaison au collagène
1.4.1.3. La protéine de liaison à la fibronectine
1.4.1.4. La protéine de liaison au fibrinogène (clumping factor)
1.4.1.5. Les sidérophores
1.4.1.6. La coagulase
1.4.1.7. La staphylokinase
1.4.1.8. La FAME
1.4.2. La résistance à la phagocytose
1.4.2.1. Les exopolysaccharides capsulaires
1.4.2.2. L’apoptose des cellules épithéliales
1.4.3. Entérotoxines, TSST-1, et exfoliatines
1.4.4. Activité superantigénique
1.4.5. Rôle du système agr dans la régulation des facteurs de virulence
2. Staphylococcus aureus Résistant à la Méticilline
2.1. Emergence du SARM
2.2. Caractéristiques moléculaires du SARM
2.2.1. Gène mecA et cassette chromosomique staphylococcique
2.2.2. Composition de la SCCmec
2.2.2.1. Complexe ccr
2.2.2.2. Complexe mec
2.2.2.3. Les régions J
2.2.1. Nomenclature de SCCmec
2.2.2. La leucocidine de Panton-Valentine
2.3. Méthodes de détection de la résistance à la méticilline
2.3.1. Identification de l’espèce S. aureus
2.3.2. Spectrométrie de masse de type MALDI-TOF
2.3.3. Test céfoxitine
2.3.4. Screning test à l’oxacillin
2.3.5. Détection du gène mecA par PCR
2.3.6. Détection rapide des SARM
2.3.7. La résistance à la méticilline due au variant mecALGA251
2.4. Typage moléculaire de SARM
2.4.1. Profil de macro restriction génomique par électrophorèse en champs pulsé (pulsotype ou analyse PFGE)
2.4.2. Techniques basées sur la PCR
2.4.2.1. La PCR multiplex
2.4.2.2. La PCR en temps réel (Real time PCR ou RT-PCR)
2.4.2.3. La Rep PCR (Repetitive Palindromic Extragenic Elements PCR)
2.4.2.4. La RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)
2.4.3. Techniques basés sur le séquençage
2.4.3.1. Multilocus sequence typing (MLST)
2.4.3.2. Typage du gène spa
2.4.4. Puce à ADN
3. Epidémiologie du SARM
3.1. Epidémiologie du SARM-H
3.2. Principaux clones mondiaux de SARM-H
3.3. Epidémiologie du SARM communautaires.
3.3.1. Origine du SARM-C
3.3.2. Définition du SARM-C
3.3.3. La prévalence du SARM-C
3.3.3.1. La situation aux États-Unis : la souche USA300
3.3.3.2. Les SARM communautaires en Europe
3.3.3.3. La situation en Algérie
3.3.4. Infections à SARM-C
3.3.5. Emergence du SARM-C comme cause d’infections associées aux soins
3.3.6. Implications de l’émergence du SARM-C comme pathogène hospitalier
3.4. Facteurs de risques d’acquisition de SARM
3.5. Un nouveau clone de SARM émergeant : ST398
4. Antibiotiques anti-staphylococciques
4.1. Introduction
4.2. Acide pseudomonique
4.2.1. Mécanisme d’action de la mupirocine
4.2.2. Mécanisme de résistance
4.3. Aminoglycosides ou Aminosides
4.3.1. Mécanisme d’action des aminosides
4.3.2. Mécanisme de résistance
4.4. Antibiotiques phosphoniques
4.4.1. Mécanisme d’acion des antibiotiques phosphoniques
4.4.2. Mécanisme de résistance
4.5. β-Lactamines
4.5.1. Mécanisme d’action des β-lactamines
4.5.2. Mécanisme de résistance
4.5.2.1. Résistance aux β-lactamines par production de β-lactamases
4.5.2.2. Résistance à la méticilline
4.5.2.3. Autres mécanisme de résistance à la méticilline
4.6. Fluoroquinolones
4.6.1. Mécanisme d’action des fluoroquinolones
4.6.2. Mécanisme de résistance
4.7. Fusidanines
4.7.1. Mécanisme d’action des fusidanines
4.7.2. Mécanisme de résistance
4.8. Glycopéptides
4.8.1. Mécanisme d’action des glycopeptides
4.8.2. Mécanisme de résistance
4.9. Lipopeptides
4.9.1. Mécanisme d’action des lipopeptides
4.9.2. Mécanisme de résistance
4.10. Macrolides, Lincosamides et Synergystines (MLS)
4.10.1. Mécanisme d’action des macrolides, lincosamides et synergystines
4.10.2. Mécanisme de résistance
4.11. Oxazolidinones
4.11.1. Mécanisme d’action des oxazolidinones
4.11.2. Mécanisme de résistance
4.12. Phénicolés
4.12.1. Mécanismes d’action des phénicolés
4.12.2. Mécanisme de résistance
4.13. Rifamycines
4.13.1. Mécanisme d’action des rifampycines
4.13.2. Mécanisme de résistance
4.14. Sulfamides et Triméthoprime
4.14.1. Mécanisme d’action des sulfamides en association ou non avec le triméthoprime
4.14.2. Mécanisme de résistance
4.15. Tétracyclines et Glycilcyclines
4.15.1. Mécanisme d’action des tétracyclines et des glycilcyclines
4.15.2. Mécanisme de résistance
5. Mesures et control des infections à SARM
5.1. Dépistages des patients
5.2. Dépistage du personnel
5.3. Isolement et précaution barrière
5.4. Hygiène des mains
CHAPITRE 3 : MATERIELS ET METHODES
1. Plan de l’étude
2. Lieu et période de l’étude
3. Procédure de l’étude
3.2. Critères d’inclusion et de non-inclusion
3.4. Etude bactériologique
3.4.1. Prélèvement et transport
3.4.2. Protocol de recherche de S. aureus dans les produits pathologiques
3.4.3. Antibiogramme
3.4.4. Recherche de la résistance de Staphylococcus aureus à l’oxacilline
3.4.4.1. Test de diffusion du disque de céfoxitine
3.4.4.2. Test de screening à l’oxacilline
3.4.5. Conservation des souches
3.4.6. Identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF
3.4.6.1. Principe
3.4.6.2. Préparation de la matrice IVD HCCA
3.4.6.3. Préparation des échantillons.
3.4.6.4. Validation des résultats
3.5. Etude moléculaire
3.5.1. Préparation du tampon de lyse
3.5.3. Identification moléculaire des souches de S. aureus et détection du gène mecA
3.5.3.1. Principe
3.5.3.2. Produits de biologie moléculaire
3.5.3.3. Souches de contrôle
3.5.3.4. Mode opératoire
3.5.3.5. Mesure de la fluorescence
3.5.3.6. Résultats
3.5.4. Détection de la leucocidine de Panton-valentine (PVL)
3.5.5. Typage du gène spa
3.5.5.1. La PCR
3.5.5.2. Réaction de séquence
3.5.5.3. Purification par Sephadex
3.5.5.4. Détermination du Spa type : Alignement des séquences avec Bioedit
3.5.6. Multilocus sequence typing (MLST)
3.5.6.1. La PCR
3.5.6.2. Réaction de séquence
3.5.6.3. Purification par sephadex
3.5.6.4. Détermination du Sequence Type (ST)
3.5.7. Typage SCCmec
3.5.7.1. M-PCR 1 (complexe ccr)
3.5.7.2. M-PCR 2 (complex mec)
3.5.7.3. Interprétation SCCmec
3.2. Analyse statistique
CHAPITRE 4 : RESULTATS
1. Présentation des prélèvements
2. S. aureus : données épidémiologiques et cliniques
2.1. Identification de l’espèce S. aureus
2.2. Taux de densité d’incidence des infections à S. aureus
2.3. Caractéristiques démographiques des patients
2.4. Répartition des patients selon les hôpitaux
2.5. Répartition des patients selon le type de service
2.6. Les différentes infections causées par S. aureus
2.7. Répartition des infections à S. aureus selon les tranches d’âge
2.8. Répartition des infections à S. aureus selon l’origine de l’acquisition
3. SARM et SASM : données épidémiologiques et cliniques
3.1. Fréquence des SARM
3.2. Taux de densité d’incidence des infections à SARM
3.3. Répartition des SARM et SASM selon le sexe et les tranches d’âge des patients
3.4. Répartition des SARM et SASM selon le type de service
3.5. Répartition des infections à S. aureus en fonction des souches SARM et SASM
3.6. Répartition des infections à S. aureus selon la résistance à la méticilline et l’origine d’acquisition
3.7. Répartition des infections à SARM selon le type d’infection et l’origine d’acquisition
4. Résistance des Staphylocoques aux antibiotiques
4.1. Résistance des SARM aux antibiotiques
4.1.1. Fréquence de la résistance
4.1.2. Profil de résistance des SARM
4.2. Résistance des SASM aux antibiotiques
4.2.1. Fréquence de la résistance
5. Caractéristiques moléculaire des SARM
5.1. Typage du gène spa
5.1.1. Séquences du gène spa
5.1.1.1. spa t037
5.1.1.2. spa t932
5.1.1.3. spa t044
5.1.1.4. spa t376
5.1.1.6. spa t005
5.1.2. Répartition des souches SARM en fonction du type spa
5.1.3. Répartition des SARM-H et/ou SARM-C selon le spa type
5.1.4. Profil de résistance aux antibiotiques des différents spa types
5.2. Typage SCCmec
5.2.1. Résultats de la M-PCR 1 (complexe ccr)
5.2.2. Résultats de la M-PCR 2 (complexe mec)
5.2.3. Répartition des souches SARM en fonction de la cassette chromosomique staphylococcique
5.2.4. Répartition des SARM-H et/ou SARM-C selon le type SCCmec
5.3. MLST et identification des différents clones isolés
5.4. La toxine de Panton-Valentine
5.4.1. Fréquence de la PVL
5.4.2. Distribution de la PVL selon les clones isolés
5.4.3. Caractéristiques des infections à SARM PVL+
5.4.4. Comparaison entre infections à SARM PVL+ et SARM PVL-
5.4.5. Résistance aux antibiotiques des SARM PVL+ versus SARM PVL-
5.4.6. Résistance des SARM PVL+ selon l’origine d’acquisition
CHAPITRE 5 : DISCUSSION
1. La situation épidémiologique
1.1. Incidence et fréquence de SARM en milieu hospitalier
1.2. Contrôle du SARM
1.3. Facteurs de risque
1.4. Epidémiologie des infections à SARM
2. Résistance aux autres antibiotiques
2.1. Glycopeptides
2.2. Aminosides
2.3. Macrolides et lincosamides
2.4. Fluoroquinolones
2.5. Autres antibiotiques
3. Epidémiologie moléculaire
Conclusion
Bibliographie
ANNEXES
