Cours les outils du génie génétique, tutoriel les enzymes du génie génétique document pdf.
Les plasmides
Les plasmides ont « Ori » et sont capables de se maintenir dans les bactéries. Leur taille est variable (de 4000pb à 10.000pb).
En 1972, on a vu que les bactéries devaient être compétentes pour réaliser la « transformation bactérienne » : entrée d’ADN extérieur. Les facteurs de compétence sont le phosphate de calcium et la température.
Les plasmides ne seront pas utilisés pour les génomes de grande taille : le rendement de transformation diminue avec la taille (on a le maximum avec 10.000pb).
On va réaliser une combinaison entre le phage λ et un plasmide.
Les cosmides
Les cosmides sont des vecteurs hybrides portant à la fois :
– des séquences d’origine phagique permettant leur encapsidation in vitro (séquence cos).
– des séquences d’origine plasmidique : gène de résistance à un antibiotique et séquence permettant au plasmide de se répliquer dans une bactérie comme un simple plasmide (séquence Ori).
Ceci permet de se dispenser des régions essentielles de l’ADN du phage et de construire des ADN recombinants portant jusqu’à 45 kb d’ADN étranger.
Une fois que l’on a placé l’insert (fragment de 45kb), on réalise l’encapsidation et la mise en place de la queue.
Pour avoir un banque complète de cDNA , on prend 10 fois plus de bactéries que de nécessaire.
Les YAC (yeast artificial chromosome) ou chromosome de levure
Ces vecteurs de clonages peuvent se présenter sous deux formes : une forme circulaire, permettant sa manipulation chez E. Coli (et en particulier l’insertion d’ADN exogène et son amplification ils possèdent une séquence ori et un gène de résistance à un antibiotique) et une forme linéaire, obtenue après coupure par BamHI et EcoRI et qui permet d’obtenir les deux “bras” du YAC. Ces deux bras contiennent les télomères (TEL), une origine de réplication levure (ARS) un centromère (CEN) ainsi que des gènes (URA et TRP) utilisés pour la sélection des clones. La ligation de ces bras à un très grand fragment d’ADN humain (100 à 1000 kb) extrait de cellules en culture le transforme en pseudo chromosome de levure capable après introduction dans ce microorganisme de se répliquer (grâce à ARS), de stabiliser ses extrémités (grâce aux séquences TEL) et de se répartir entre les cellules filles lors de la division cellulaire (grâce à la séquence CEN).
Toutefois, ces YAC ont une affreuse tendance à se recombiner avec les chromosomes de la levure. En général, on ajoute entre 2.10 5pb et 2.10 6pb.
Banque de cDNA
Dans un individu, on isole un type cellulaire et l’on focalise dessus. Pour l’homme, on a entre 20 et 30 cDNA différents.
A partir d’ARNm polyA, on passe au cDNA, que l’on insère ensuite dans un vecteur lequel est transféré dans des bactéries.
La reverse transcriptase
On va hybrider des oligodT (25) sur la queue polyA, c’est ensuite que l’on ajoute la reverse transcriptase et les dNTP. Une fois le travail de la reverse transcriptase achevé, on élimine l’ARN avec la nucléase S1.
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