Les outils bioinformatiques d’analyse des séquences de l’ADN

Tables des Matières

1. Introduction
2. Objectifs
2.1. Objectif Général
2.2. Objectifs Spécifiques
3. Généralités5
3.1 Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH)
3.1.1 Historique de découverte du VIH /Sida
3.1.2 Définition et classification du VIH/Sida
3.1.3 Structure et morphologie du VIH
3.1.4 Stabilité physico-chimique
3.1.5 Cycle de réplication
3.1.6 Cellules cibles et réservoir du virus
3.1.7 Mode de transmission et Evolution naturelle de la maladie
3.1.7.1 Mode de transmission
3.1.7.2 Evolution naturelle de la maladie
3.2 Epidémiologie
3.3 Diversité génétique
3.3.1 Mécanismes de la diversité génétique
3.3.2 Conséquences de la diversité génétique
3.4 Répartition géographique
3.5 Diagnostique biologique au laboratoire
3.5.1 Diagnostic indirect ou sérologique
3.5.2 Diagnostique directe
3.5.3. Séquençage
3.5.3.1Séquençage de l’ADN
3.5.4.2. Les outils bioinformatiques d’analyse des séquences de l’ADN
3.5.4.2.1. Objet de la bioinformatique
3.5.4.2.2. Analyse des séquences
3.6 .Traitement
3.6.1. Objectifs du traitement antirétroviral
3.6.2. Obstacles
3.6.3. Différentes classes thérapeutiques.
3.6.4. Nouvelles molécules antirétrovirales.
3.6.5 Stratégies de traitement antirétroviral.
3.6.6. Echec thérapeutique
3.6.6.1. Echec virologique
3.6.6.2. Echec immunologique
3.6.6.3. Echec clinique
3.6.7. Observance28
3.6.8. Résistance du VIH aux antirétroviraux
3.6.8.1 Définition28
3.6.8.2 Mécanisme d’apparition des mutations de résistance
3.6.8.3 Mécanisme de la résistance aux antirétroviraux
3.6.8.4 Les analogues nucléosidiques de la transcriptase inverse (INTI).
3.6.8.5 Inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI)
3.6.8.6 Inhibiteurs de protéase (IP)
3.6.8.7 Les inhibiteurs d’entrée.
3.6.8.8 Inhibiteurs d’intégrase (INT)
3.6.8.9 Les tests de résistance
3.6.8.10 Indications et critères d’utilisation des tests de résistance
3.6.8.11 Critères de demande de génotypage (cas du Mali)
4. Méthodologie
4.1 Type et période d’étude
4.2 Cadre et lieu d’étude
4.3 Population d’étude
4.4 Critères d’inclusion
4.5 Critères de non inclusion
Mis en forme : Police :Gras
Mis en forme : Police :Non Gras, Couleur de police : Automatique
4.6 Méthodes utilisées
4.6.1 Technique Abbott HIV-1 Real Time TM
4.6.1.1 Principe
4.6.1.3 Procédure de la technique
4.6.2 La technique VIROSEQTM
4.6.2.1 Principe de la technique
4.6.2.2 Organisation de la paillasse
4.6.2.3 Réactifs et matériels
4.6.2.4 Préparation des échantillons
4.6.2.5 Réaction de la RT-PCR
4.6.2.6 Réaction de la PCR
4.6.2.7 Préparation des produits de PCR pour la réaction de séquence
4.6.2.8 Réaction de séquence
4.6.2.9 Préparation des échantillons à charger dans le séquenceur
4.6.2.10 Détection des mutations et analyse des données
4.6.3 Prélèvement et stockage des échantillons
4.7 Echantillonnage
4.8 Analyse des données
5. Résultats
6. Commentaires et Discussion
7. Conclusion et Recommandations
7.1 Conclusion
7.2 Recommandations
8. Références Bibliographiques

Epidémiologie

Bien que le sida demeure l’un des défis de santé les plus importants du monde, la solidarité internationale qui s’est mise en place au cours de la dernière décennie pour lutter contre ce fléau continue de générer d’extraordinaires progrès. Combinée à l’émergence de nouveaux outils efficaces conçus pour prévenir les nouvelles infections et les décès liés au sida, la réussite spectaculaire de l’élargissement et de l’intensification des programmes liés au VIH a permis de jeter les bases de l’éradication définitive de cette maladie.[2] À l’échelle mondiale, 34 millions [31,4 – 35,9 millions] de personnes vivaient avec le VIH à la fin de l’année 2012. Selon les estimations, 1,12 % des enfants (<15 ans) dans le monde entier vit avec le VIH bien que les circonstances de l’épidémie qui pèsent sur les pays et les régions continuent de varier considérablement.
L’Afrique subsaharienne reste l’une des régions les plus gravement touchées avec près de 2,9 millions des cas de VIH, ce qui représente 88% des personnes vivant avec le VIH dans le monde. La prévalence régionale de l’infection à VIH est près de 25 fois plus élevée en Afrique subsaharienne qu’en Asie mais environ 5 millions de personnes vivent avec le virus dans l’ensemble de l’Asie du Sud, du Sud-est et de l’Est. À l’échelle mondiale, le nombre de nouvelles infections continue de diminuer : le nombre de personnes (adultes et enfants confondus) infectées par le VIH en 2012 (2.3 million [1.9 million – 2.7 million]) Était de 20 % inférieur à celui de 2001. Là encore, les variations sont flagrantes. Les baisses les plus importantes du nombre de nouvelles infections à VIH depuis 2001 ont été observées dans les Caraïbes (42 %) et en Afrique subsaharienne (25 %).[2] Au Mali, les résultats de la dernière étude de séroprévalence de l’infection à VIH réalisée en 2012 dans la population générale adulte au cours de l’Enquête Démographique et de Santé (EDS M-V), ont montré une baisse du taux de prévalence du sida de 1,3% à 1,2% faisant du Mali un pays à faible prévalence. Globalement, les femmes sont plus touchées que les hommes (respectivement 1,3% et 0,8%). Le pic de séroprévalence se situe, aussi bien chez les femmes que chez les hommes, dans la tranche d’âge 30-34 ans (2,2%), témoignage d’une épidémie bien installée.

Diversité génétique 

Celle-ci tient au processus même de multiplication de ces virus qui sont obligés de transformer leur ARN génomique en ADN pour s’intégrer dans la cellule hôte. Dès 1985, une variabilité génétique importante des VIH a été mise en évidence; il n’existe pas  deux virus identiques, même au sein d’un même individu. Cette diversité génétique, due différents mécanismes (faible fiabilité de la TI, haut niveau de réplication, recombinaison génétique) peut avoir des conséquences sur la réponse aux traitements antirétroviraux. Le VIH est divisé en deux “groupes”, VIH-1 et VIH-2 qui proviennent de 2 événements de transmission inter-espèces différents, issus respectivement du Chimpanzé et du Sootey Mangabey.
Les analyses phylogénétiques du VIH-1 à partir de différents isolats ont permis de le classifier en 4 groupes génétiques M (main), O (outlier), N (non-M, non-O) et le dernier groupe P découvert récemment par l’équipe de Plantier.La majorité des infections par le VIH est causée par le groupe M, les infections par les groupes N et O étant restreintes à l’Afrique centrale. Dans le groupe M, 9 sous-types sont reconnus et désignés par les lettres A-D, F-H, J et K, les variations génétiques entre les sous types allant de 25 à 35% selon les sous-types et les régions du génome considérés[21]. Il existe également des variations au sein d’un sous-type, entre 15 et 20%, tels que le sous type F, divisé en sous sous-types F1 et F2 et le sous-type A en A1, A2 et A3. Les analyses de tout le génome ont révélé l’existence de virus recombinants inter sous-types, issus de patients surinfectés ou Co-infectés. Ces virus recombinants sont appelés CRFs (Circulating Recombinant Forms) lorsqu’ils ont été identifiés chez au moins 3 individus non liés épidémiologiquement et caractérisés sur tout le génome. Dans le cas contraire, ils sont appelés URFs (Unique Recombinant Forms), plus de 200 actuellement. A ce jour 51 CRFs ont été identifiés, les recombinants CRF01_AE et CRF02_AG jouant un rôle important dans les épidémies régionales.

Mécanismes de la diversité génétique

Ces mécanismes sont essentiellement dus à trois aspects :
• Faible fiabilité de la transcriptase inverse
Qui est incapable de corriger les mésappariements introduits lors de la polymérisation de l’ADN proviral et commet un taux d’erreur d’environ un par cycle, soit une erreur introduite par cycle.
• Grande capacité de réplication :
Le haut niveau de la réplication du VIH (estimé à 10 individu infecté) induit une variabilité de la population virale au sein même de l’individu appelé quasi-espèce, à cause de la faible fiabilité de la TI.
• Recombinaison génétique :
La production de virus recombinants nécessite deux cycles viraux successifs. Lors du premier cycle viral, deux virus différents infectent une même personne, simultanément ou non. Il en résulte une cellule hébergeant deux provirus au sein de son génome. En effet le génome du VIH étant composé d’un ARN dimérique, la TI a la capacité de passer d’une molécule d’ARN à l’autre lors de la transcription inverse, créant ainsi un ADN proviral chimérique.
 Mécanismes de la diversité génétique
Ces mécanismes sont essentiellement dus à trois aspects :
Faible fiabilité de la transcriptase inverse :
Qui est incapable de corriger les mésappariements introduits lors de la polymérisation de l’ADN proviral et commet un taux d’erreur d’environ un par cycle, soit une erreur introduite Grande capacité de réplication : action du VIH (estimé à 109 – 1010 virions produits par jours chez un individu infecté) induit une variabilité de la population virale au sein même de l’individu espèce, à cause de la faible fiabilité de la TI.

Recombinaison génétique 

Production de virus recombinants nécessite deux cycles viraux successifs. Lors du premier cycle viral, deux virus différents infectent une même personne, simultanément ou non. Il en résulte une cellule hébergeant deux provirus au sein de son génome.t le génome du VIH étant composé d’un ARN dimérique, la TI a la capacité de passer d’une molécule d’ARN à l’autre lors de la transcription inverse, créant ainsi un ADN proviral Qui est incapable de corriger les mésappariements introduits lors de la polymérisation de l’ADN proviral et commet un taux d’erreur d’environ un par cycle, soit une erreur introduite virions produits par jours chez un individu infecté) induit une variabilité de la population virale au sein même de l’individu production de virus recombinants nécessite deux cycles viraux successifs. Lors du premier cycle viral, deux virus différents infectent une même personne, simultanément ou non. Il en t le génome du VIH étant composé d’un ARN dimérique, la TI a la capacité de passer d’une molécule d’ARN à l’autre lors de la transcription inverse, créant ainsi un ADN proviral Résistance aux antirétroviraux chez les enfants et adolescents infectés par le VIH, suivis au service de pédiatrie du CHU GABRIEL TOURE.

 Conséquences de la diversité génétique

La diversité génétique du VIH-1 résulte d’un taux élevé de la réplication couplé à une faible fidélité de la TI et au phénomène de recombinaison génétique, elle est due à différents mécanismes, et a des impacts multiples sur le diagnostic (sérologique, charge virale) et notamment sur la réponse au traitement antirétroviral. Les tests de dépistage, reposant sur des antigènes du VIH-1 du sous-type B prévalent en occident et qui peuvent avoir une sensibilité moindre vis-à-vis des autres sous-types de groupe M appelé non B.
• Certaines études laissent entendre que la résistance aux ARV varierait selon les sous types : par exemple, le groupe O du VIH-1 pourrait présenter une sensibilité moindre aux INNTI.
• Ainsi des études ont montré que plus de 50% des virus non B infectant des patients naïfs portent au moins trois mutations mineures de résistances aux IP, alors qu’elle n’est que 8% pour le B[15] La question de la sensibilité aux ARV, et particulièrement aux inhibiteurs de protéase des souches présentant un grand polymorphisme génétique reste posée.
• La diversité génétique du VIH constitue un obstacle à la mise au point de vaccins efficaces. En effet, la majorité des candidats vaccins, faisant actuellement l’objet d’essais cliniques ont été créés au moyen de souches de VIH-1 de sous-type B (prédominant en Amérique du Nord et en Europe).
Cependant, on ignore jusqu’à quel point ces vaccins pourraient conférer une protection Croisée entre les autres sous-types, notamment ceux prédominant en Afrique.
• La recombinaison entre différents types et sous-types peut induire des conséquences génétiques et biologiques de loin plus importantes que celle résultant de l’accumulation stable d’une simple mutation au sein d’un type ou d’un sous-type unique.
• La sélection des mutations à l’échec, les profiles d’échappement peuvent également être différent selon le sous type de VIH-1. En effet, certaines mutations spécifiques aux sous-types peuvent être sélectionnées lors du traitement, par exemple le sous-type C, qui présente de nombreuses spécificités..