Les modèles simiens d’infection léntivirale

Le modèle singe vert d’Afrique

Il existe quatre espèces de singes verts d’Afrique (sabaeus, tantalus, vervets et grivets) qui sont infectés par des virus SIV spécifiques appelés SIVagm.sab, SIVagm.tan, SIVagm.ver et SIVagm.gri respectivement. L’infection des singes verts par SIVagm est persistante et asymptomatique comme chez les autres porteurs naturels de SIV (3, 4, 80, 148, 185, 246).
Cette infection est endémique chez les populations sauvages de singes verts avec des taux deséroprévalence compris entre 30 et 50% (146, 167, 234, 246). La majorité des souches SIVagm inoculés aux macaques par voie intra-veineuse ne sont pas pathogènes, à l’exception d’une seule qui a provoqué un syndrome d’immunodéficience (81) chez des macaques nemestrina.
La primo-infection chez le singe vert est comparable sur différents points à celle observée dans le modèle pathogène. En effet, la primo-infection chez les singes verts sabaeus (85) et a montré qu’au  niveau périphérique, le plus grand nombre de copies d’ADN viral (entre 104 et 105 copies pour 1million de cellules) a été observé 10 jours après l’infection chez trois des quatre animaux inoculésavec des cellules et du plasma infectés. Pour le quatrième animal le pic a été observé dès le 7ème jour après l’infection. La charge virale ARN plasmatique étaitmaximale entre J7 et J14 avec desvaleurs comprises entre 104 et 107 copies par ml de plasma.
Au niveau des ganglions, il a été observé que les pics de charge virale ADN et ARN étaient également observés entre le 7ème et le 10ème jour après l’infection, avec des valeurs un peu plus faibles (entre 103 et 3.104 copies d’ARN pour 1 million de cellules). Au bout de 14 à 21 joursaprès l’infection, les charges virales ADN baissent de 2 à 3 log dans les deux compartimentset atteignent les valeurs pendant la phase chronique de l’infection, à savoir entre 102 et 103 copie d’ADN viral pour 1 million de cellules. De même, les charges virales ARNdiminuent de 1 à 4 log en périphérie pour atteindre des valeurs comprises entre 10 et2.103 copies par ml de plasma. Après les pics de charge virale, la décroissance est de 1 à 2 log avant J21, puis de même amplitude jusqu’à trois mois après l’infection. Par ailleurs les ganglions durant la primo-infection ne subissent aucun changement morphologique majeur et ne présentent ni hyperplasie folliculaire ni infiltration de cellules CD8+ dans les centres germinatifs (85). Des études montrent l’infection des organes lymphoïdes qui conserventcependant une architecture normale et la charge virale ganglionnaire a été évaluée à unecellule infectée pour 104 cellules (123). En dépit du tropisme préférentiel du SIVagm.sab pour les lymphocytes T CD4+ simiens, les singes verts ne développent pas de lymphopénie T CD4+ (96). L’infection des vervets par SIVagm.ver a montré au cours de la primo-infection, undéclin transitoire des cellules CD3+CD4+ dans le sang des animaux dont la charge virale étaitélevée, accompagné de signes d’activation transitoire des cellules CD4+, CD8+ aussi biendans le sang, qu’au niveau des ganglions entre J7 et J17 (autour du pic de virémie) aprèsinfection. Ces résultats suggèrent une absence d’augmentation de l’activation cellulaire durantla phase chronique car faible pendant la phase aiguë, et contrastant avec les observation faitesde l’infection lentivirale pathogène (182). Les singes verts infectés développent une réponseimmune humorale dirigée contre le virus. Cependant la réponse en anticorps dirigée contre laprotéine majeure core (p26) est faible voire absente chez ces animaux (80, 185, 240) et cettecaractéristique est partagée par d’autres hôtes naturels de virus SIV tels que les mandrills(321) et les mangabés (269) contrairement à ce qui est observé chez l’homme. Par contre, le macaque à queue de cochon et les babouins infectés par SIVagm développent une très forteréponse humorale anti-p26 (15, 149, 180). La signification de cette faible réponse humorale,contre la protéine p26 du SIVagm chez l’hôte naturel, n’est pas connue mais pourrait être à lereflet de mécanismes impliqués dans l’absence de pathogénicité. Les vervets infectés parSIVagm, développent également des anticorps neutralisants, mais le titre apparaît faible (240).
Cette neutralisation devient plus sensible après exposition à des molécules CD4 solubles (4) et cet effet est supprimé en présence d’anticorps obtenus chez des animaux naturellement infectés (2 ,4, 341). La description d’anticorps, produits pendant la phase précoce del’infection, capables de neutraliser le virus après son attachement à la molécule CD4 (5) est en faveur d’un changement conformationnel de la gp120 consécutif à son interaction avec lamolécule CD4. Comme chez l’homme, il semblerait que les singes verts infectés ne développent pas non plus d’anticorps cytotoxiques capables d’induire la lyse des cellules infectés en présence de complément (240). L’activité ADCC, ainsi que l’activité cytotoxiquenon restreinte par le CMH, est inférieure à celle retrouvée chez l’homme infecté par le VIH-1 et le macaque rhésus infecté par le SIVmac (267). L’activité CTL est probablement faiblependant la phase chronique de l’infection (239).Par ailleurs les monocytes macrophages sont sensibles à l’infection SIVagm (4, 108) de même que les lignées cellulaires T humaines comme les Molt4clone8, les C8166, les CEM et les SupT1 in vitro (185, 240, 246). Par ailleurs, le SIVagm a la capacité d’utiliser, en plus de la molécule CD4 (4, 96), au moins trois co-récepteurs CCR5, STRL33 (Bonzo) et gpr15 (Bob) pour rentrer dans la cellule (56, 82). Enfin, aucune induction d’apoptose n’a été mise enévidence après activation des lymphocytes T CD4+ in vitro (98). En outre, la charge virale apparaît faible chez les vervets infectés naturellement, à savoir 0,5 à 5 copies d’ADN proviralpour 106 PBMC circulants (138), mais des variations individuelles sont observées. La mise encause de l’absence de pathogénicité dû à la faible réplication du SIVagm chez son hôte naturelest controversée (22, 96, 233). D’autres facteurs pourraient expliquer l’absence depathogénicité, par exemple les lymphocytes T CD8+ de vervets secrètent un facteur solublecapable d’inhiber la réplication du SIVagm in vitro. Cependant la présence de ce facteurn’explique pas à lui tout seul l’infection asymptomatique chez le singe vert, puisqu’un facteursimilaire est décrit chez l’homme infecté par le VIH-1 (68, 96, 334, 335).
Des études récentes ont démontré que le niveau de virémie, plasmatique et tissulaire, au coursde la phase aiguë et chez les singes verts naturellement infectés étaient comparable à celle observée dans le modèle pathogène (37, 124). Par ailleurs, le contrôle de cette virémie aucours de la primo-infection ne serait pas la seule raison de la résistance de l’hôte à la progression de la maladie (158).

Autres infections non pathogènes ches les singes d’Afrique

Exemples d’infection naturelle non pathogène identifiés à ce jour:
– le mandrill (321)
– le cercopithèque à diadème (91)
– le talapoin (33)
– le drill (67)
– le singes De Brazza (66)
– des singe Mona (66)
– le cercopithèque wolfi (284)
– et le cercopithèque ascanius (284)
Ces animaux ne semblent pas développer la maladie malgré l’infection virale persistante. Les premières données sur le mandrill et le cercopithèque diadème indiquent qu’ils présentent une faible réponse humorale dirigée contre la protéine majeure du core p25 (246), comme cela fut observé pour le singe vert. De même, très peu d’informations sont disponibles sur l’infectionnaturelle du cercopithèque l’hoesti par le SIVlhoest, des mangabey à crêtes rouge par le  SIVrcm, des drills par le SIVdrl, singes De Brazza par SIVdeb, singes Mona par SIVmona,Cercopithèque wolfi par SIVwol et cercopithèque ascanius par SIVasc. Contrairement au SIVsyk, le SIVlhoest et le SIVrcm sont capables d’infecter de manière productive des PBMC humains et de macaques. Une des particularités biologiques du SIVrcm par rapport aux virus des autres espèces de mangabey est son incapacité à infecter la lignée cellulaire CEMx174, ce qui traduit probablement une différence dans l’utilisation des corécepteurs. L’isolat SIVrcm95GB1 semble présenter un profil unique parmi les VIH/SIV de par sa capacité à utiliser le co-récepteurs CCR2b et non-CCR5 (216). Aucune pathologie n’a pu être reliée aux SIV chez leurs hôtes naturels respectifs, alors qu’ils peuvent induire un SIDA chez des espèces hétérologues. Ces modèles non pathogènes sont d’un grand intérêt pour l’étude des facteurs impliqués dans la résistance à la maladie et pour le moment ils sont aussi informatifs que les SHIV non pathogènes.

MATERIEL ET METHODES

Matériel

Matériel biologique

Singes verts d’Afrique

Tous les animaux utilisés dans cette étude sont des singes verts d’Afrique (ou African GreenMonkeys : AGM) appartenant à l’espèce Chlorocebus sabaeus, capturés au Sénégal etmaintenus en captivité à l’Institut Pasteur de Dakar (IPD). Ces animaux ont été testés pour la présence d’anticorps anti-SIV et anti-STLV, par Elisa et Western-Blot à l’aide de testscommerciaux (Platelia HTLV1 Bio-rad ; Lav blot II Diagnostics Biotechnology).
La définition de l’âge chez les singes verts a été basée sur l’analyse de critères physiques etmorphologiques (114). Ainsi, on peut définir trois classes qui sont :
– Les jeunes (de la naissance jusqu’à environ 18 mois)
– Les juvéniles (animaux ayant entre 18 mois et 3 ans)
– Les sub-adultes/adultes (au-delà de 3 et 4 ans pour les femelles et les mâles respectivement ).
Tous les animaux utilisés, huit AGM au total (00021, 03005, 02004, 03007, 03006, 02015, 02024, 97029) sont des singes juvéniles ou sub-adultes/adultes.
L’AGM 03007 a reçu une dose de 1010 CFU (Colony Forming Unit) de BCG (voir chap2.1.1.3) en 5 points de part et d’autre de la colonne vertébrale en injection sous-cutanée
Les AGM 00021 et 02024 ont reçu chacun 108 CFU de BCG en 5 points de part et d’autre dela colonne vertébrale en injection sous-cutanée
Les singes AGM 03005 et 02015 ont reçu chacun 106 CFU de BCG en 5 points de part et d’autre de la colonne vertébrale en injection sous-cutanée
Les AGM 02004 et 97029 ont reçu chacun une dose de 104 CFU de BCG en 5 points souscutanésde part et d’autre de la colonne vertébrale
Et enfin l’AGM 03006 a reçu une dose de 0,05 ml de BCG qui est la dose infantile en 5 pointssous-cutanés de part et d’autre de la colonne vertébrale.
Après une anesthésie à la kétamine (Imalgène®1000 à 0.1ml par kg), un prélèvement de sang est effectué par ponction de la veine fémorale pour chacun des animaux afin de procéder à des examens complémentaires. Entre 5 et 10 ml de sang ont été recueillies dans un tube contenant un anti-coagulant (EDTA ou Héparine). Une partie a été utilisée pour la Numération Formule sanguine (NFS) et l’autre partie a servi à isoler les cellules mononuclées circulantes afin decaractériser les différentes sous populations lymphocytaires.

Cellules

Dix à vingt millilitres de sang sont prélevés sur tube hépariné et centrifugés pendant 5 minutes à 1800 rpm à 20°C. Après centrifugation, le plasma est retiré et congelé à –80°C pour le dosage ultérieur des cytokines plasmatiques, tandis que le culot restant est dilué de moitié avec du PBS 1X. Ce sang dilué est délicatement déposé sur un gradient de densité (FicollHypaque, Sigma) et centrifugé à 1800 rpm pendant 30 minutes à 20°C. L’anneau de PBMC est récupéré et lavé 3 fois dans 15 ml de RPMI 1640 par centrifugation (10 minutes à 1800 rpm). Après la dernière centrifugation, 10 µl de suspension cellulaire sont prélevés pour effectuer une numération sur une cellule de Malassez, après coloration par 10 µl de bleu de trypan 0,4% afin de visualiser les cellules vivantes au microscope.

Virus

Les virus SIVagm utilisés pour les infections expérimentales correspondaient à despopulations virales non cultivées in vitro, pour éviter une sélection in vitro des variants viraux et rester le plus proche possible des virus inoculés lors d’infections in natura.
Le stock viral a été constitué à partir du singe donneur AGM 92018 qui est naturellement infecté. Les PBMCs et le plasma de cet animal ont été inoculés à l’AGM 00008. À J11 postinfection, le plasma a été prélevé puis le titre infectieux a été déterminé sur cellules SupT1 par une méthode en dilution limite sur plaque de culture cellulaire.
Le titre infectieux a été exprimé comme étant la dose virale permettant d’infecter 50% des cellules en culture (TCID50) (par détection de l’Ag Gag p27 par test ELISA).

Bactéries et protéines

La préparation BCG nous a été fournie par Nathalie Winter de l’institut Pasteur Paris, il s’agit de la souche vaccinale Pasteur 1173 P2 de Mycobacterium bovis bacillus CalmetteGuerin (BCG).
Le vaccin BCG SSI est un vaccin lyophilisé fabriqué à partir d’une souche atténuée de Mycobacterium bovis, souche danoise 1331. 1ml de vaccin reconstitué contient 0,75 mg de Mycobacterium bovis souche danoise 1331.
La tuberculine Purified Protein Derivative (PPD) (ou dérivé de protéine purifiée de tuberculine) est un liquide clair composé de PPD à partir de souches sélectionnées de Mycobacterium tuberculosis. La tuberculine PPD est produite en concentration de 2 Unités de Tuberculine (1 UT correspond à 0,02 µg de tuberculine PPD)

Réactifs et Tampons

Réactifs

– Bleu trypan : 4 V solution de bleu trypan à 20% , 1 V NaCl 75 mM
– Milieu Complet : RPMI 1640 contenant 10% de Sérum de Vœu Fœtal, 10% d’IL-2, 1% de Pénicilline – Streptomycine, 1% de L – Glutamine
– Milieu de congélation : Sérum de Vœu Fœtal à 90% + 10% de Diméthylsulfoxide
– Milieu de décongélation : RPMI 1640 contenant 20% de Sérum de Vœu Fœtal
– Milieu normal : RPMI 1640 contenant 10% de Sérum de Vœu Fœtal , 1% Pénicilline streptomycine et 1% L – Glutamine
– Diméthylsulfoxide : DMSO (Sigma D 5879 – 100 ml)
– Tétraméthylbenzidine : TMB (Sigma T 0440 – 100 ml)
– Ficoll-paque (Pharmacia Biotech)
– RPMI 1640 (Bio Wittaker)
– SVF : Sérum de Vœu Fœtal (Gibco Life Technologies) décomplémenté 30 min à 56°C
– IL2 : Interleukine 2 (200 U/ml, Biotest)
– Concanavaline A : ConA (1 mg/ml Poly Labo) Concentration finale d’utilisation de 5 µg/ml
– Nunc Immuno plates, cat no 12-565-136, 0.4 ml, 96 puits, fond plat.
– Anticorps anti-singe fabriqué chez la chèvre IgG-h+1 HRP conj. (Conc 1 mg/ml, Bethyl, cat no A140-102P)
– Anticorps anti-singe fabriqué chez la chèvre IgG, M, A (h+1) HRP (Conc. 1 mg/ml, Rockland Inc, code no 617-103-130, lot 13253).
– Tween 20 : Sigma P9416, 100 ml
– BSA : Bovine Sérum Albumin, Stem cell Technologies, Cat
– Azide de Sodium : S-2002, 100g, Sigma
– Carbonate acide de Sodium NaHCO3 401676-2,5 kg, Sigma
– Carbonate de sodium : Na2CO3 S2127, Sigma

Tampon

– PBS 10X (GIBCO BRL) : KCl : 0,2 g/l KH2PO4 : 0,2 g/l NaCl : 80 g/l Na2HPO4 : 21,6 g/l
– PBST ou PBS-Tween: 0.5 ml Tween-20 dissous dans 1L PBS
– PBST-B : 2 ml BSA (Bovine Serum Albumin) solution (10%) added to 18 ml PBST (pour une plaque).
– Tampon de Block : 2 ml BSA solution (10%) sont ajoutés dans 18 ml PBS (pour uneplaque)
– Substrat : constitué de capsule de perborate de sodium
– Solution d’arrêt : H2SO4 2 N
– Tampon de Coating : Na2CO3 : 5,3 g/l
NaHCO3 : 4,2 g/l
Azide de Sodium : 1 g/l
Ajuster le PH à 9,6
– Tampon de lavage : PBS 0,1% Tween 20
– Tampon de Block : PBS 3% BSA

Techniques de Culture cellulaire

Deux techniques ont été utilisées, une culture directe des PBMC et une co-culture des PBMC avec des cellules de lignées (SupT1, Molt4 Clone8 )

Congélation 

Une suspension cellulaire contenant 5.106 cellules est centrifugée pendant 5 min à 1800 rpmet le culot est re-suspendu dans 0,9 ml de SVF pur + 0,1 ml de DMSO. Les cellules sont congelées 2 heures à –20°C puis transférées à –80°C.

Décongélation 

Les cellules sont décongelées rapidement à 37°C au bain marie et immédiatement diluée au1/10 dans du RPMI froid contenant 20% de SVF. Après 5 min de centrifugation à 1800 rpm et un deuxième lavage avec du RPMI contenant 20% de SVF, les cellules sont re-suspendues dans le milieu de culture habituel.

Culture directe de PBMC

Les cellules vivantes sont comptées après coloration au bleu de trypan, puis centrifugées 5min à 1800 rpm. Les culots de PBMC sont re-suspendus dans du milieu complet à uneconcentration de 106 cellules par ml en présence de l’IL-2 qui est un facteur de croissance descellules T. Les cultures sont incubées à 37°C en atmosphère humide contenant 5% de CO2 etle milieu renouvelé tous les 3 jours. Les cellules sont stimulées avec de la Concanavalin A à 15 µg/ ml ou la PPD à 10 µg / ml pendant 5 jours.

Co-culture avec des PBMCs ou des lignées

Compte tenu de la faible croissance des PBMCs animaux in vitro et des effets cytopathogènesréalisés par les virus en culture directs, les PBMCs des animaux infectés ont été misen en coculture. Ces co-cultures ont été réalisées dans les buts suivants : faciliter l’isolementdes
virus, maintenir la production virale indéfiniment afin d’obtenir un important stock viral.Pour les lignées (Molt4cl8 ou SupT1), les lymphocytes de l’animal infecté sont stimulés pendant 3 jours. Le mélange se fait alors dans un rapport de 2/1 entre les PBMCs simiens infectés stimulés et les cellules de lignées, dans un milieu normal à 10% SVF et à uneconcentration cellulaire de 0,5. 106 / ml.

Isolement et propagation des SIV

Culture directe

Les PBMCs sont isolés, mis en culture directe, stimulés et régulièrement suivis selon lesméthodes décrites ci-dessus. Dès l’apparition éventuelle de syncitia et une diminution de la croissance cellulaire du à l’effet cytopathogène de certaines souches virales, des PBMCssimiens non infectées et stimulées depuis 3 jours dans le milieu complet (avec IL-2), sont ajoutées une fois toutes les deux semaines afin de maintenir la production virale, est mise enévidence par mesure de l’antigène p27 (Kit ag-p27 SIV, Coulter) dans les surnageants deculture. Les surnageants des cultures positives sont alors aliquotés et conservés à –80°C. Ils constituent une source de virus infectieux.

Co-culture avec des cellules de lignées

Des co-cultures avec des lignées cellulaires continues (SupT1, Molt4 Clone8). Après 3 jours de stimulation par le mitogène (Con A), les PBMCs sont progressivement éliminés de la culture, et seules les cellules de lignées sont productrices de virus. Cependant ce procédé présente l’inconvénient de sélectionner les variants viraux qui s’adaptent à la lignée cellulaire utilisée. Le virus ainsi produit n’est pas forcément représentatif de la population présente in vivo. Aussi n’est elle utilisée que pour la mise en évidence du virus dans les lymphocytes du sujet lorsque l’isolement est difficile et non pour la caractérisation des virus.