Généralités 

La plupart des techniques bactériologiques : isolement, identification, conservation, numération des bactéries, exigent l’utilisation de milieux de culture.
Ainsi un milieu de culture doit réunir des conditions physico-chimiques pour favoriser la croissance des germes recherchés dans les prélèvements.
La constitution d’un milieu de culture et son choix, mettent en jeu les notions de nutrition, de croissance bactérienne ainsi que l’objectif recherché à travers la mise en culture des bactéries.

Définition 

Les milieux de culture se définissent comme étant la préparation de substances, sous forme liquide, semi-liquide ou solide, qui contiennent des composants naturels et/ou synthétiques destinés à permettre la multiplication (avec ou sans inhibition de certains microorganismes ) ou l’identification ou à préserver la viabilité des microorganismes (NF T 90-461 juillet 2001)

Qualités exigibles d’un milieu de culture 

Les qualités ci- dessous décrites sont indispensables à un milieu pour favoriser le développement bactérien (17).

La composition 

Les milieux de culture doivent contenir quantitativement et qualitativement les aliments exigés pour la croissance et l’entretien des microorganismes et assimilables par eux :
– aliments essentiels azotés et carbonés
– facteurs de croissance (métabolites essentiels que la bactérie est incapable de synthétiser)
– facteurs stimulants ou facteurs de départ dont la présence accélère le rythme de la multiplication bactérienne ou permet l’adaptation à un milieu artificiel d’une bactérie isolée d’un milieu naturel.

Le pH 

En général, les bactéries ne se développent qu’à un pH voisin de la neutralité (7 à 7,6) ; Certaines d’entre elles exigent ou supportent un pH particulier (application à leur isolement ou leur identification).

L’ isotonie 

Elle correspond pour la plupart des milieux à celle d’une solution de NaCl à 9 g ‰, soit environ 300 milliosmoles.

Le rH 

En ce qui concerne le potentiel d’oxydoréduction, les bactéries ont des exigences strictes, en rapport avec leurs types respiratoires.

L’ humidité 

L’eau est nécessaire au métabolisme bactérien ; les milieux de culture doivent en contenir une quantité suffisante. Il est également indispensable que l’incubation soit effectuée à la température optimale de croissance des bactéries à cultiver.

La gélose Plate Count Agar (PCA) 

La gélose standard pour dénombrement (PCA) est préparée selon la normefrançaise N.F. 04-505 et les recommandations de « l’American Public Health »Elle est utilisée pour le dénombrement des germes aérobies totaux dans les eaux,le lait, les viandes et produits à base de viande, et autres denrées alimentaires(16).

MATERIEL

Cadre des analyses 

Ce travail a été effectué au niveau du laboratoire d’Hygiène et Industries des Denrées Alimentaires d’Origine Animale (HIDAOA), de l’Ecole Inter- états des Sciences et Médecine Vétérinaires de Dakar.

Produits Analysés 

Ce sont essentiellement des filets de soles prélevés dans une usine de la place où ils ont été déjà manipulés, emballés puis congelés.

Matériel de prélèvement 

Une glacière soigneusement nettoyée avec de l’alcool et contenant des outres carboglace ont été utilisés pour maintenir la chaîne du froid.

Matériel de laboratoire 

Le matériel de travail est celui communément utilisé dans les laboratoires de bactériologie :
• Matériel de prélèvement : ciseaux, pinces, scalpels
• Matériel d’incubation : étuve 30°C
• Matériel d’homogénéisation : STOMACHER ND
• Matériel de stérilisation : autoclaves, four pasteur
• Milieux de culture et réactifs : PCA, Marine Agar et EPT
• Verrerie
• Divers : becs bunsen

METHODES

Dénombrement de la flore totale 

Dénombrer la flore totale, c’est tenter de compter tous les microorganismes présents, afin d’apprécier la contamination microbienne du produit. Or il n’estpas possible de dénombrer à la fois les microorganismes aérobies et anaérobiesstricts. C’est pourquoi il est préférable d’utiliser le terme « microorganismesaérobies totaux à 30°C » que plutôt la flore totale.

Références normatives 

Elles correspondent aux normes françaises (NF) et internationales (ISO) appliquées à la recherche de la flore totale pour les produits solides. Elles sont consignées dans le tableau suivant.

Préparation de la solution mère et des dilutions décimales 

La préparation de la solution mère consiste à prélèvement aseptiquement 10g defilet de sole et à les introduire dans un sachet STOMACHER ND. 90 ml d’eau peptonée tamponnée sont ensuite ajoutés au contenu du sachet pourobtenir la solution mère titrant 1/10.
L’homogénéisation du contenu du sachet se fait pendant environ trois (3) minutes au STOMACHER ND. Cette suspension contenant des microorganismes est laissée au repos pendant 30 minutes pour assurer leur revivification.
A partir de la solution mère, de plus petites dilutions décimales sont réalisées pour faciliter le dénombrement.

Préparation des milieux de culture 

Pour cette préparation, les facteurs d’appréciation des milieux de culture sont considérés.

La fertilité 

L’utilisation des deux milieux (PCA et MA ) a été synchrone afin de pouvoir comparer les résultats et en déduire la fertilité de chacun.

La stérilité 

Les deux milieux sont coulés chacun dans une boîte stérile, puis fermée et incubée à l’étuve 30°C pendant 72 heures. Au terme de ce délai la lecture est faite.

La sélectivité

Le PCA et le Marine Agar, du fait de leur faible sélectivité, sont utilisés en double couche pour éviter l’envahissement de leurs surfaces par des germes de contamination.

Le pH 

Chaque jour, le pH de chaque milieu est mesuré après étalonnage de l’appareil.

La salinité 

Après préparation de chaque milieu, la salinité est mesurée à l’aide d’un salinomètre. Cette mesure consiste à :
 Introduire la pointe du capteur dans la matière ; les électrodes plaquées d’or doivent être entièrement immergées.
 Lire la salinité relative sur l’écran.

La température

La température de chaque échantillon est mesurée par un thermomètre avant le prélèvement.

Préparation de l’eau peptonée tamponnée 

Suspendre 20g de poudre dans un litre d’eau distillée ou déminéralisée. Chauffer jusqu’à complète dissolution et stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes. Le pH préconisé est de : 7,0 ±0,2 à 25°C.

Préparation des deux milieux 

La préparation des deux milieux se fait de la même manière ; après la pesée ( PCA : mettre 23,5g de poudre dans 1 litre d’eau distillée, MA : mettre 55,1g de poudre en suspension dans 1 litre d’eau purifiée ) et l’homogénéisation, les milieux sont bouillis jusqu’à dissolution complète et stérilisés à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

Mode opératoire 

Les dilutions 10-4 et 10-5 ont été utilisées. 1 ml de solution est prélevé aseptiquement de chaque tube de dilution et coulé avec une première couche de 15 à 18 ml de PCA ou de MA préalablement fondus et ramenés à 45 – 50°C, dans une boîte de Pétri. L’inoculum et le milieu de culture sont bien homogénéisés par des mouvements circulaires de la main, dans un sens, puis dans l’autre. Après solidification, une deuxième couche de 5ml est ajoutée ; puis les boîtes de Pétri sont incubées, retournées (couvercle vers le bas).
L’incubation se fait à l’étuve à 30°C pendant 72h. A l’issue de ce délai a lieu la lecture.

Comptage des colonies 

La lecture se fait sur les deux boîtes de Pétri ensemencées. Seules les coloniessituées entre les deux couches de PCA et Marine Agar sont dénombrées. Pourque le dénombrement de la flore totale soit fiable, il faut que le nombre de bactéries compté par boîte soit compris entre 15 et 300.

Expression des résultats 

Cas général 

Boîte contenant moins de 300 colonies au niveau de deux dilutions successives,avec une boîte renfermant au moins 15 colonies.
Le calcul du nombre N de microorganismes par gramme ou millilitre de produitest obtenu à l’aide de l’équation suivante:

Traitement des données 

Les données ont été saisies sous Microsoft – Excel et le logiciel SPSS.
Ensuite la statistique descriptive ( moyenne, écart type, minimum, maximum ), aété calculée. Le test de student (t) a été également utilisé pour comparer les moyennes des deux milieux de culture.