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Agrégation des molécules amphiphiles

Les molécules amphiphiles à l’interface eau-air sont également en équilibre avec des molécules amphiphiles en solution. Au delà d’une certaine concentration, appelée concentration micellaire critique, ces molécules en solution, initialement isolées, peuvent se regrouper en mettant en contact leurs parties hydrophobes. La formation de tels agrégats isole les chaînes hydrophobes des molécules d’eau et minimise ainsi l’énergie du système. Selon la géométrie des molécules amphiphiles (structure de la chaîne hydrophobe, taille de la tête hydrophile relativement à celle de la chaîne hydrophobe) et les propriétés physico-chimiques de la solution (concentration en sels, pH, température, etc.) ces agrégats vont pouvoir adopter différentes structures (figure I-2 – Israelachvili, 1992).

Monocouche d’amphiphiles – Isothermes de compression

Les molécules amphiphiles très insolubles préfèrent s’adsorber à la surface de l’eau plutôt que de rester en solution. Elles s’organisent alors à l’interface eau-air en une couche monomoléculaire (ou monocouche). Ces couches d’amphiphiles qui se forment spontanément à la surface de l’eau sont appelées films de Gibbs. Il est également possible de former une couche monomoléculaire d’amphiphiles par un dépôt direct des molécules à la surface de l’eau. La méthode consiste à dissoudre les molécules amphiphiles dans un solvant organique très volatile qui s’étale bien à la surface de l’eau puis de déposer quelques gouttes de la solution à l’interface eau-air. Le solvant s’étale alors uniformément sur la surface puis s’évapore très rapidement en laissant une couche monomoléculaire d’amphiphiles.
Considérons à présent deux interfaces séparées l’une de l’autre par un flotteur : la première (à gauche) est une interface eau-air et la deuxième (à droite) est une interface eau-air sur laquelle a été déposée une monocouche d’amphiphiles (figure I-3). La surface à gauche du flotteur, qui n’est constituée que de molécules d’eau, est plus désireuse de minimiser son aire que la surface à droite du flotteur, qui comporte des molécules amphiphiles. Cette différence de tension de surface a tendance à attirer le flotteur du côté où il n’y pas de molécules amphiphiles, en exerçant la force : δF = (γ e − γm )l (I-2)
Où : γe est la tension de surface de l’eau, γm la tension de surface de la monocouche et l la longueur du flotteur.
Le terme π = γe – γm est appelé pression de surface de la monocouche. Il est l’analogue, à deux dimensions, de la pression que l’on rencontre, à trois dimensions, dans les gaz. On peut en effet se représenter la monocouche comme une assemblée de molécules amphiphiles qui sont libres de se déplacer dans le plan de l’interface eau-air et qui viennent se heurter sur les parois de la cuve. Ainsi, si l’on diminue l’aire accessible à la monocouche, les molécules amphiphiles se retrouvent serrées les unes contre les autres ; elles sont alors beaucoup moins libres de diffuser et interagissent plus fortement entre elles : la pression de surface augmente. D’une façon analogue au cas à trois dimensions, on peut tracer des isothermes représentant la pression de surface π en fonction de l’aire σ accessible à chaque molécule amphiphile (σ est aussi appelée l’aire moléculaire). Ces mesures sont réalisées sur une balance de Langmuir (chapitre II-1). Lors de la compression de la monocouche on peut observer, selon la nature des molécules amphiphiles, le passage par différentes phases dont les transitions sont marquées par des plateaux – dans le cas des transitions de phase du premier ordre – ou des changements de pente – dans le cas des transitions de phase du second ordre (figure I-4). A partir d’une certaine pression, appelée pression de collapse, la monocouche atteint son état de compactage maximum et devient très instable. Si l’on poursuit la compression, les molécules amphiphiles quittent la surface de l’eau pour partir en solution ou forment des multicouches à l’interface eau-air (figure I-5).

Bicouche fixe d’amphiphiles – Prélèvements de Langmuir-Blodgett

Une monocouche se trouvant à l’interface eau-air peut être transférée sur une surface solide (Gaines, 1966). Pour y parvenir, il faut utiliser un substrat hydrophile ayant une forte affinité pour les têtes polaires de la molécule amphiphile. Le substrat est plongé initialement en solution puis il est tiré hors de l’eau. Lorsqu’il traverse l’interface eau-air, il accroche les têtes polaires des molécules amphiphiles et devient alors hydrophobe (figure I-6). Afin d’obtenir un dépôt homogène sur le substrat, on doit prélever à aire moléculaire constante donc à pression constante. La perte de molécules en surface est donc compensée en permanence par une compression de la monocouche. Il est ensuite possible de déposer une nouvelle monocouche d’amphiphiles (qui peut être différente de la première). Il suffit pour cela que le substrat traverse l’interface eau-air dans l’autre sens ; les molécules amphiphiles se fixeront cette fois par l’intermédiaire de leur queue hydrophobe. On peut, de cette manière, déposer plusieurs monocouches sur un substrat ; les molécules amphiphiles se greffant alternativement par l’intermédiaire de leur tête hydrophile et de leur queue hydrophobe.
La qualité du dépôt est déterminée par le rapport de prélèvement qui est défini comme le rapport entre l’aire moléculaire à la surface de l’eau et l’aire moléculaire à la surface du substrat. En pratique, pour l’obtenir, on calcule le rapport entre l’aire dont a varié la monocouche durant le dépôt et l’aire de la surface du substrat. Un bon dépôt aura un rapport proche de 1.

Bicouche libre d’amphiphiles – Vésicules

Formation et propriétés mécaniques des vésicules

Les molécules amphiphiles dont la tête hydrophile a une taille du même ordre de grandeur que la queue hydrophobe préfèrent s’agréger en formant des bicouches plutôt que des micelles (voir figure I-2) ; c’est le cas de la plupart des molécules amphiphiles possédant deux chaînes hydrophobes. De plus, dans certaines conditions, il peut être énergétiquement plus favorable pour les molécules amphiphiles de s’agréger en formant des bicouches sphériques fermées (ou vésicules) plutôt que des bicouches planes (figure I-7).
Cette structure en bicouche sphérique fermée est tout à faire similaire à celle de l’armature lipidique des cellules vivantes. Les vésicules constituées de phospholipides synthétiques sont, pour cette raison, souvent étudiées comme des membranes modèles. Les vésicules sont également beaucoup étudiées et utilisées en raison des propriétés mécaniques particulières de leur membrane (chapitre II-3). La membrane d’une vésicule est très fine (environ 5 nm) et offre peu de résistance au phénomène de courbure ; elle est libre d’onduler et de se déformer sous l’effet de l’agitation thermique. Quand la membrane s’incurve, la courbure est limitée par les deux phénomènes antagonistes de confinement et d’extension subits respectivement par les monocouches interne et externe. La membrane d’une vésicule offre par contre une grande résistance au phénomène d’étirement, liée à la cohésion entre les molécules amphiphiles qui la constituent. La conséquence directe est qu’une vésicule évoluant librement en solution aqueuse possède une aire constante.
Les vésicules peuvent également exister à l’état multilamellaire (la lamellarité correspond au nombre de bicouches constituant le système). On distingue plusieurs types de vésicules que l’on classe en fonction de leur taille et de leur lamellarité. Les “Multi Lamellar Vesicles” (MLV) sont constituées de plusieurs bicouches et peuvent atteindre quelques micromètres ; on les appellent aussi “oignons”. Les “Giant Unilamellar Vesicles” (GUV), “Large Unilamellar Vesicles” (LUV) et “Small Unilamellar Vesicles” (SUV) sont, quant à elles, constituées d’une seule bicouche et ont respectivement des tailles de l’ordre de 10 µm, 1 µm et 0,1 µm.
Plusieurs techniques permettent de fabriquer des vésicules. Le principe en est toujours le gonflement, par hydratation, d’un film d’amphiphiles qui a été préalablement séché. Ce gonflement peut se faire d’une façon spontanée (Reeves, 1969 – Needham, 1988) ou par application d’un champ électrique oscillant (Angelova, 1992). La deuxième méthode permet d’obtenir des GUV avec un très bon rendement (90% de vésicules unilamellaires). Dans le cadre de nos expériences nous avons utilisé la première méthode qui est plus simple à mettre en oeuvre et qui donne également de très bons résultats.

Pression osmotique – Morphologie des vésicules en solution aqueuse

Les bicouches de molécules amphiphiles se comportent comme des membranes perméables vis-à-vis des molécules d’eau. Les vésicules sont donc très sensibles à la pression osmotique du milieu dans lequel elles se trouvent.
Rappelons tout d’abord quelques notions liées à la pression osmotique. Lorsque deux solutions présentent des concentrations différentes de solutés, la solution la plus concentrée est dite hypertonique et la solution la moins concentrée est dite hypotonique. Si les deux solutions présentent la même concentration de solutés, elles sont dites isotoniques. Considérons une membrane qui sépare deux milieux ayant des concentrations de solutés différentes et qui est perméable aux molécules d’eau mais pas aux molécules de solutés (on parle alors de membrane semi-perméable). L’eau diffusera de la solution hypotonique vers la solution hypertonique. Ce phénomène qui tend à égaliser la concentration des deux milieux est appelé osmose. La pression osmotique, ou osmolarité, d’une solution peut être définie comme sa capacité à gagner des molécules d’eau lorsqu’elle est séparée d’un réservoir d’eau pure par une membrane semi-perméable. Dans le cas de solutions très diluées, elle est proportionnelle à la concentration du soluté et est donnée par la loi de Van’t Hoff : p = k BT ρsoluté (I-3) Où : ρsoluté est la concentration moléculaire du soluté.
Ainsi, si une membrane semi-perméable sépare deux solutions ayant des pressions osmotiques différentes, les molécules d’eau diffuseront de la solution ayant la pression osmotique la plus faible vers la solution ayant la pression osmotique la plus forte.
Les deux milieux qui se trouvent à l’intérieur et à l’extérieur des vésicules peuvent avoir des pressions osmotiques différentes. La membrane des vésicules se comportant comme une membrane semi-perméable, la forme des vésicules en solution aqueuse dépend fortement des valeurs relatives de ces pressions osmotiques. Si les vésicules sont plongées dans un milieu dont la pression osmotique est supérieure à celle qui règne en leur sein, l’eau diffuse de l’intérieur vers l’extérieur des vésicules. L’équilibre est atteint lorsque les deux pressions osmotiques deviennent égales. Dans ce cas de figure, la membrane des vésicules a une tension nulle ; les vésicules sont flasques (figure I-8a). Si les vésicules sont plongées dans un milieu dont la pression osmotique est inférieure à celle qui règne en leur sein, l’eau diffuse de l’extérieur vers l’intérieur des vésicules. Les vésicules gonflent et l’équilibre est atteint lorsque la tension de la membrane compense la différence de pression osmotique entre les deux milieux. Dans ce cas de figure, la membrane des vésicules est mise sous tension ; les vésicules sont sphériques (figure I-8b). La différence de pression entre l’intérieur et l’extérieur de la vésicule est reliée à la tension de sa membrane par l’équation de Laplace. pi − pe = 2τ (I-4) Où : τ est la tension de membrane de la vésicule et R est son rayon moyen.
Si les vésicules sont plongées dans des solutions très diluées, dont la pression osmotique est très faible, il peut arriver que les membranes se tendent jusqu’à dépasser les limites de leur élasticité et qu’elles se rompent. Dans ce cas, les vésicules explosent ; elles sont détruites par choc osmotique.

Les forces intervenant entre deux bicouches de molécules amphiphiles

Nous allons présenter les différentes forces qui peuvent intervenir entre deux bicouches de molécules amphiphiles immergées en solution aqueuse.

Les forces électrostatiques double-couche

La surface d’une bicouche peut être chargée suite à l’ionisation de la tête hydrophile des molécules amphiphiles qui la composent ou suite à l’adsorption d’ions provenant de la solution. Si l’on rapproche l’une de l’autre deux bicouches chargées, il apparaît entre elles une répulsion de nature électrostatique dont la portée dépend de la concentration des ions en solution. Nous allons établir l’expression de cette répulsion dans le cas modèle de deux surfaces solides chargées interagissant dans une solution d’électrolyte ; les résultats que l’on obtient avec ce système modèle s’appliquent relativement bien au cas de deux bicouches d’amphiphiles.
Considérons deux surfaces solides planes de même charge séparées d’une distance D et plongées dans une solution d’électrolyte (figure I-9). Les ions de la solution portant une charge opposée à celle des surfaces (les contre-ions) ont tendance à se rapprocher des surfaces alors que les ions de même charge ont tendance à s’en éloigner. La couche de contre-ions qui se développe alors au voisinage des surfaces écrante leur charge et à partir d’une certaine distance (de l’ordre de quelques longueurs de Debye) les surfaces sont vues comme des surfaces neutres. On rappelle que la longueur de Debye λD s’écrit : λD = εo εr k BT (I-5) ∑zi2e2ρi (∞) Où : ε0 et εr sont respectivement la permittivité du vide et la permittivité relative de la solution d’électrolyte et où zi et ρi(∞) sont respectivement la valence des ions i et leur concentration loin des surfaces (en volume).

Table des matières

Introduction
Chapitre I : Généralités
1. Bicouches de molécules amphiphiles
1-1. Présentation des molécules amphiphiles
1-1-1. Structure
1-1-2. Tension de surface
1-1-3. Agrégation des molécules amphiphiles
1-2. Monocouche d’amphiphiles – Isothermes de compression
1-3. Bicouche fixe d’amphiphiles – Prélèvements de Langmuir-Blodgett
1-4. Bicouche libre d’amphiphiles – Vésicules
1-4-1. Formation et propriétés mécaniques des vésicules
1-4-2. Pression osmotique – Morphologie des vésicules en solution aqueuse
2. Les forces intervenant entre deux bicouches de molécules amphiphiles
2-1. Les forces électrostatiques double-couche
2-2. Les forces de van der Waals
2-2-1. L’interaction de van der Waals entre deux molécules
2-2-2. L’interaction de van der Waals entre deux surfaces solides
2-2-3. L’interaction de van der Waals entre deux bicouches
2-2. Les forces de nature stérique
2-2-1. L’interaction d’ondulation d’Helfrich
2-2-2. L’interaction péristaltique
2-2-3. L’interaction de protrusion
2-2-4. L’interaction entre bicouches recouvertes de polymères
2-3. Les forces d’hydratation
2-3-1. Les forces oscillatoires entre deux surfaces solides
2-3-2. Les forces d’hydratation entre deux bicouches d’amphiphiles
2-4. Les forces spécifiques
2-4-1. Les liaisons hydrogène
2-4-2. Les liaisons par chélation
2-4-3. Les liaisons récepteur-ligand
3. Les rétinoïdes
3-1. Fonction biologique de l’acide rétinoïque
3-1-1. Rappel sur la synthèse et la structure des protéines
3-1-2. Mode d’action de l’acide rétinoïque
3-2. Les récepteurs de l’acide rétinoïque
3-2-1. Différents types de récepteurs
3-2-2. Structure du récepteur et liaison au ligand
3-2-3. Oligomérisation des récepteurs
3-2-4. Ligands synthétiques des récepteurs
Chapitre II : Dispositifs Expérimentaux
1. La balance de Langmuir
2. L’appareil de mesure de forces entre surfaces (SFA)
2-1. Les surfaces d’étude
2-2. Le système de déplacement des surfaces
2-3. Le principe de mesure de la distance
2-4. Le principe de mesure de la force
2-5. Energie d’interaction et énergie d’adhésion entre les surfaces
3. La technique des vésicules micromanipulées
3-1. Préparation et observation des surfaces d’étude
3-2. Mesure de l’énergie d’adhésion entre deux vésicules micromanipulées
4. Les outils moléculaires
4-1. Les lipides NTA et NTA-Ni
4-2. Les récepteurs possédant une étiquette histidine
4-3. Le lipide rétinoïde
Chapitre III : Mesure d’une Liaison Hydrogène
1. Isothermes et stabilité des lipides NTA et NTA-Ni dans l’eau pure
1-1. Isothermes des lipides NTA et NTA-Ni à l’interface eau-air
1-2. Stabilité des monocouches NTA et NTA-Ni à l’interface eau-air
1-3. Dépôt de Langmuir-Blodgett et stabilité des bicouches dans l’eau pure
1-3-1. Rapports de prélèvement
1-3-2. Stabilité des bicouches
2. Mesures de forces dans l’eau pure
2-1. Profils de force NTA/NTA et NTA-Ni/NTA-Ni
2-2. Profils de force DMPE/DMPE, MeT/T et MeT/A
2-3. Comportement “sticky fluid” des monocouches de lipide NTA
2-4. Energies d’adhésion macroscopiques
2-5. Estimation de l’énergie d’une liaison hydrogène
3. Conclusion
Chapitre IV : Mesure d’une Liaison par Chélation
1. Isothermes et stabilité des lipides NTA et NTA-Ni dans le Tris
1-1. Isothermes des lipides NTA et NTA-Ni à l’interface Tris-air
1-2. Stabilité des monocouches NTA et NTA-Ni à l’interface Tris-air
1-3. Rapports de prélèvement et stabilité des bicouches dans le Tris
2. Mesures de forces dans le Tris
2-1. Profils de force NTA/NTA, NTA/NTA-Ni et NTA-Ni/NTA-Ni
2-2. Répulsion électrostatique double-couche et répulsion stérique
2-2-1. Répulsion électrostatique double-couche
2-2-2. Répulsion stérique
2-3. Traitement statistique des courbes expérimentales
2-3-1. Comportement moyen pour chaque configuration expérimentale
2-3-2. Longueur de Debye
2-3-3. Densités de charge des surfaces
2-3-4. Forces de séparation effectives
2-4. Estimation de l’énergie d’une liaison par chélation
3. Mesures par la technique des vésicules micromanipulées
3-1. Préparation des vésicules
3-2. Energies d’adhésion macroscopiques
3-3. Estimation de l’énergie d’une liaison par chélation
4. Conclusion
Chapitre V : Mesures de Forces Impliquant des Rétinoïdes
1. Tests d’affinité entre la molécule d’hexahistidine et le lipide NTA-Ni
1-1. Mesures de pressions de surface
1-1-1. Mesures à aire moléculaire fixée
1-1-2. Mesures d’isothermes
1-2. Mesures de fluorescence
1-2-1. Mesures par microscopie de fluorescence classique
1-2-2. Mesures par microscopie à deux photons
1-2-3. Spécificité de la liaison de la GFP-6His au lipide NTA-Ni
2. Mesures de forces entre deux couches de récepteurs des rétinoïdes
2-1. Fixation des récepteurs sur des monocouches de lipide NTA-Ni
2-2. Fixation des récepteurs sur des monocouches de lipide rétinoïde
2-2-1. Isotherme et stabilité du lipide rétinoïde dans le Tris
2-2-2. Profils de force récepteurs/récepteurs
3. Mesures de forces entre une monocouche de lipide rétinoïde et une couche de récepteurs RXR
4. Mesures de forces dans l’eau pure entre deux monocouches de lipide rétinoïde : un exemple d’interaction entre deux surfaces hydrophobes
5. Conclusion
Conclusion
Références

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