Les différentes espèces des Entérobactéries isolées

Mode, collecte et analyse des données

Nous avons collecté les données contenues dans le ogiciel de laboratoire HEXALIS® à l’Institut Pasteur de Madagascar. Ensuit e, on a relevé à partir de ce logiciel l’âge et le genre du patient, la nature de prélèvements, la notion d’hospitalisation et d’antibiothérapie en cours.
En plus, l’appareil de lecture de l’antibiogramme A DAGIO ™ à l’Institut Pasteur de Madagascar nous a fourni le(s) germe(s) isolés et leur(s) sensibilité(s) aux antibiotiques
On a effectué une analyse univariée à partir du test de Chi avec un seuil de signification de p < 0.05.

Examen cytobactériologique des prélèvements respiratoires

Sécrétions broncho-pulmonaires

Les sécrétions bronchiques peuvent être soient une expectoration, une aspiration bronchique ou une aspiration endotrachéale.
Dans la réalisation de leurs examens cytobactériologiques, deux étapes ont été suivis selon le Référentiel en Microbiologie médicale (REMIC) et le protocole interne du laboratoire.
Dans un premier temps on procède à l’examen direct. On réalise une coloration de Gram et de May-Grünwald Giemsa (MGG) sur les frottis. Par la suite, une numération des cellules épithéliales et des leucocytes (grossissement x 100) par champ est réalisée en faisant une moyenne sur 10 champs.
Le tableau suivant permet de déterminer la classe de l’expectoration selon la méthode microscopique de Bartlett-Murray et Washington:
Les scores de 1 à 3 reflètent une contamination salivaire et la mise en culture ne doit pas être réalisée et les scores 4 et 5 sont acceptables pour l’examen bactériologique.
En deuxième temps, on procède à la mise en culture. Les secrétions sont d’abord fluidifiées volume à volume dans du Fluidifiant (Mucofluid®) préalablement dilué au 1/10 ou Digesteur Eurobio®) puis homogénéisées pendant 2 minutes sur vortex puis laissées 15 min à température ambiante (sous PSM ou Poste de Sécurité Microbienne).
Ensuite, une dilution à 10 -3 en physiologique stérile c’est-à-dire 10µL du mélange dans 10 ml d’eau physiologique stérile. A partir de cette dilution, prendre 10µL à l’aide d’une anse calibrée de 10µL puis ensemencer par épuisement sur les milieux de culture suivant :
· Gélose au sang
· Gélose au sang + ANC,
· Gélose chocolat Polyvitex,
· Gélose Drigalski
· Gélose Sabouraud Chloramphénicol.
Après 24 et 48 heures d’incubation à 35°C ± 2 (sous CO2 seulement pour gélose au sang et gélose chocolat Polyvitex), le seuil de pathogénicité est de 10 UFM/ml (soit ≥ 50 colonies).

Liquide broncho-alvéolaire

Deux étapes constituent leurs examens bactériologiques.
Premièrement, l’examen direct. Deux frottis sont réalisés par cytocentrifugation pour la coloration de MGG et de Gram. Ceci permet :
– d’évaluer et d’apprécier le nombre de leucocytes etd’hématies (objectif x 10) par « Absence, Rares, Quelques, Assez nombreux, Nombreux, Très nombreux »
– de faire le pourcentage de polynucléaires infectéset de rechercher la présence de bactéries et de levures
La présence des cellules épithéliales à plus de 25par champ témoigne une contamination salivaire.
Ensuite pour la culture, le dénombrement des bactéries est réalisé à partir de l’échantillon pur et d’une dilution au 1/100 (mettre 10 µL de l’échantillon dans 1 ml d’eau physiologique stérile). Prendre 10µL de chaque échantillon puis déposer et ensemencer par épuisement sur les milieux de cultures suivants :
· Gélose au sang
· Gélose au sang + ANC,
· Gélose chocolat Polyvitex,
· Gélose Drigalski
· Gélose Sabouraud Chloramphénicol.
Après 24 et 48 heures d’incubation à 35°C ± 2 (sous CO2 seulement pour gélose au sang et gélose chocolat Polyvitex), le seuil de pathogénicité est de 10 UFM/ml (soit ≥ 100 colonies pour l’échantillon pur et 1 colonie pour l’échantillon dilué).

Liquide de ponction pleurale

Ce prélèvement est effectué en milieu hospitalier,respectant les règles d’asepsie stricte, prélevé avant toute antibiothérapie et acheminé dans moins de deux heures au laboratoire.
En premier lieu, noter l’aspect macroscopique du liquide qui peut être citrin, hémorragique, trouble ou purulent, transparent et clair. Puis homogénéiser et centrifuger par cytocentrifugation sur Cytospin® deux frottis p our la coloration de MGG et Gram. La numération cytologique quantitative est effectué sur la cellule KOVA slide.
Ensuite, mettre une goutte de liquide dans chaque milieu de culture :
· Gélose au sang
· Gélose au sang + ANC,
· Gélose chocolat Polyvitex,
· Gélose Drigalski
· Bouillon cœur cervelle
Si présence de levure à l’examen direct, rajouter un milieu Sabouraud Chloramphénicol, incubation à 35°C ± 2pendant 15j, et lecture tous les jours.
Puis réaliser l’ensemencement par la technique de cadran. L’incubation des boîtes à 35°C ± 2 pendant 24 – 48 h :
– Gélose chocolat Polyvitex, Gélose au sang + ANC sont sous CO2
– Gélose au sang en atmosphère anaérobie
– Gélose Drigalski en milieu aérobiose.
Toutes les bactéries présentes dans les boîtes de étrip sont en principe à prendre en considération, dans chaque boîte faire une coloration Gram pour les colonies suspectes. La lecture du Bouillon cœur – cervelle s’effectue t ous les jours, pendant 05 jours.
⇒ Si positive (bouillon trouble), repiquer sur une gélose chocolat Polyvitex et une gélose sang + ANC.

Identification et technique de l’antibiogramme

Si le seuil de pathogénicité est dépassé pour chaque examen, on procède à l’identification des germes en question. Les germes sont identifiés à partir de la galerie API BioMérieux® correspondant aux résultats orientés par l’examen direct. A partir de 2014, la spectrométrie de masse avec unanalyseur à temps de vol MALDI-TOF ou « Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time of flight mass spectrometry » est utilisée pour l’identification des germes.
La méthode d’antibiogramme utilisée est la méthodede diffusion avec disque en milieu solide. Selon les germes, le degré de turbidimétrie de l’inoculum varie en fonction de la recommandation du Comité de l’Antibiogramme de la Société Française en Microbiologie (CASFM) en vigueur. Pour ce faire, prélever quelques colonies afin de réaliser une suspension d’inoculum bactérienne avecde l’eau physiologique stérile indiqué par le CASFM. Ensuite, cet inoculum bactérien est employé dans les 15mn et au plus tard dans les 60mn après sa préparation.
Les milieux de culture à utiliser pour l’antibiogra mme sont spécifiques des germes identifiés. Ecouvillonner l’inoculum sur la totalité de la surface de la gélose en trois directions. Déposer fermement les disques d’antibiotiques à la surface de la gélose inoculé et séchée. Retourner les boîtes et les incuber idéalement dans les 15 min qui suivent le dépôt des disques, sans dépasser 30 min. Incuber les boîtes à 35°C ± 2°C (avec ou sans CO2). Enfin, la lecture de l’antibiogramme se fait après 16-24 h d’incubation.
On lit le diamètre d’inhibition des disques d’antibiotique à partir du système ADAGIO™. Ce logiciel effectue une interprétation sy stématique suivant la recommandation du CASFM en vigueur.

Considération éthique

Tous au long de l’étude, nous avons gardé la confidentialité sur les informations concernant l’identité des patients.