Les biocapteurs principe de base et généralités

Immobilisation d’enzymes dans des membranes polymériques en vue d’élaborer des capteurs biologiques pour la détection des polluants organiques

Les biocapteurs

Les biocapteurs représentent un domaine de recherches important depuis plus de 50 années. Ce sont des outils analytiques applicables à de nombreux domaines tels que les sciences de la vie (agroalimentaire , médecine , biologie , l’environnement (pollution) , ou encore le bioterrorisme (prévention d’attaques biologiques) . Ces capteurs peuvent être façonnés à la demande, et la cible à détecter doit reagir avec le système biologique (enzymes, ADN, anticorps…). Un «bon» biocapteur doit cependant être sélectif, sensible, rapide, fiable, portable et bon marché. Le terme «biocapteur» représente la fusion de deux des plus importantes technologies de ce siècle: l’électronique et les biotechnologies. Leur association permet des dosages rapides, sensibles et spécifiques.

Depuis le premier biocapteur développé par L.C. Clark et C. Lyons au début des années 1960 , des efforts considérables ont été faits pour mettre au point d’autres biocapteurs dans l’objectif de réaliser des dosages rapides, sensibles et spécifiques de molécules présentant un intérêt dans le domaine médical, agroalimentaire, ou environnemental. Les études actuelles sont centrées principalement sur la recherche de nouveaux matériaux d’immobilisation des biomolécules qui n’altèrent pas leur activité et permettent de la prolonger.

Description du biocapteur

Le biorécepteur : Le biorécepteur constitue le premier maillon du biocapteur. Il permet l’identification de l’espèce à détecter grâce à son site particulièrement sélectif. Le biorécepteur assure ainsi la reconnaissance moléculaire, associée ou non à la transformation de l’espèce à mesurer. Cette modification, très localisée, de l’espèce présente dans l’échantillon, se fait généralement par l’intermédiaire d’une molécule active (par exemple : enzyme, anticorps, ADN, cellule entière, micro-organisme) immobilisée qui transforme ce substrat en un produit détectable par le transducteur. Dans un biocapteur, le biorécepteur offre une spécificité et une sensibilité élevée pour un groupe particulier d’analyte, ainsi qu’une réponse rapide.

Plusieurs types de biorécepteurs ont été utilisés comme moyen de reconnaissances moléculaires pour le développement de biocapteurs . Parmi ces biorécepteurs on cite par exemple les biocapteurs à enzymes qui utilisent généralement des enzymes spécifiques pour la capture et la génération catalytique d’un produit qui est alors directement mesuré grâce à une large gamme de transducteurs (électrochimiques, optiques, thermiques, acoustiques…). Ce type de biocapteurs à été souvent utilisé pour la quantification de contaminants tels que les pesticides, herbicides ou antibiotiques, etc.

Le biorécepteur microorganisme est utilisé comme biocapteur pour la synthèse pharmaceutique, le traitement des eaux usées et l’industrie alimentaire.
Les transducteurs : Le transducteur représente l’élément physique du biocapteur. Il sert à exploiter la modification biochimique issue d’une interaction entre un analyte et le biorécepteur pour le transformer en un signal électrique. Suivant le type de modification biochimique, on choisira le type de transducteur approprié pour exploiter au mieux l’effet créé par le biorécepteur en présence de l’espèce cible et obtenir un signal sensible, facilement exploitable avec un seuil de détection plus bas en améliorant les performances du biocapteur.
Différents systèmes de transduction, basés sur des principes différents, sont généralement utilisés afin de convertir la reconnaissance moléculaire en un signal électrique exploitable.

Détection électrochimique

Les transducteurs électrochimiques reposent sur la variation d’un courant, d’une impédance ou d’un potentiel suite à la reconnaissance moléculaire. Ils peuvent se classer suivant la grandeur observée: il existe ainsi des transducteurs ampérométriques (courant), conductimétriques (conductance), potentiométriques (potentiel) et impedimétrique (résistance) .
Détection ampérométrique : La détection par mesure ampérométrique repose sur le suivi du courant électrique associé aux électrons générés lors d’une réaction d’oxydoréduction. Après l’immobilisation de biorécepteurs à la surface d’une électrode de travail, l’interaction avec l’analyte peut provoquer une réaction directe ou indirecte de type redox, modifiant l’accumulation de charges au niveau de l’électrode par rapport à une électrode de référence.

Les mesures sont effectuées en appliquant une tension de polarisation constante entre ces deux électrodes et en mesurant le courant qui traverse le système. Le courant mesuré est directement lié à la variation de concentration des espèces électrochimiquement actives ou à la vitesse de réaction de production ou de consommation de ces espèces.
Détection conductimétrique : Le principe de la détection conductimétrique est de suivre la conductance d’un système électrode-électrolyte-électrode. Les mesures de la conductance sont effectuées en mode alternatif car la polarisation des électrodes en continu engendrerait une électrolyse. Suivant le type de capteurs, la variation de la conductance peut être liée au changement de la composition du milieu ou à des modifications des interfaces électrode/électrolyte, les électrodes pouvant être éventuellement fonctionnalisées.

Ce type de dispositif se distingue par sa simplicité de fabrication (pas besoin d’électrode de référence). Il s’est initialement développé pour des applications de détection chimique : les cellules de conductimétrie (Orion, Prolabo) sont aujourd’hui très utilisées en laboratoire et dans l’industrie. Par extension, les réactions enzymatiques, consommant ou produisant des ions en solution, ont été étudiées par cette même méthode. Plus récemment, des détections de protéines ou d’ADN ont été démontrées avec des sensibilités pouvant descendre jusqu’à des concentrations nanomolaires. La sélectivité intrinsèque de ce type de transducteur reste le facteur limitant : des optimisations sont nécessaires afin d’améliorer la sélectivité de la détection (couplage avec une membrane polymérique par exemple) et de prendre en compte les effets d’une réaction biologique sur la composition de l’électrolyte.

Applications et perspectives des biocapteurs

Les biocapteurs constituent une solution attractive permettant de fournir des systèmes simples et sélectifs pour l’analyse de différents composés. Le grand nombre d’enzymes en a fait des instruments analytiques.

De nombreuses électrodes à enzymes ont été décrites dans la littérature. La plupart n’existent qu’à l’échelle du laboratoire de recherche ; certaines ont abouti à la fabrication d’appareils commercialisés . Les biocapteurs peuvent apporter des solutions originales et efficaces à des problèmes concernant de nombreux domaines : agro-alimentaire, environnement et santé. Concernant les utilisations actuelles et potentielles des biocapteurs, on peut faire les remarques suivantes : Dans le domaine médical : Leur emploi devrait permettre de diminuer le coût des analyses. Il permet également d’envisager des analyses rapides. Les dosages les plus courants sont ceux du glucose et de l’urée dans les fluides biologiques : sang total, sérum et urine.

Dans les domaines agroalimentaire et pharmaceutique : Par exemple, le dosage de l’acide ascorbique par l’ascorbate oxydase immobilisée sur une électrode à oxygène permet le suivi de la concentration en vitamine C dans les boissons telles que la bière, les jus de fruits frais et en conserve.
Dans le domaine de l’environnement et la dépollution : Leur emploi peut faire espérer une systématisation des contrôles.

Table des matières

Introduction générale
Chapitre I : Etat de l’art sur les biocapteurs
I. Les biocapteurs : Principe de base et généralités
I.1. Historique
I.2. Définition : Qu’est ce qu’un biocapteur ?
I.3. Description du biocapteur
I.3.1. Le biorécepteur
I.3.2. Les transducteurs
I.4. Détection électrochimique
I.4.1 Détection ampérométrique
I.4.2. Détection conductimétrique
I.4.3. Les capteurs impedimétriques
I.4.4. Détection potentiométrique
I.5. Applications et perspectives des biocapteurs
Conclusion
II. Techniques d’immobilisations des biomolécules
II.1. Les méthodes d’immobilisations des enzymes
II.1.1. L’adsorption
II.1.2. La réticulation ou « Cross-linking »
II.1.3. Le greffage covalent
II.1.4. L’encapsulation
Conclusion
III. Immobilisation de la lipase pour l’application en biocapteurs
III.1. Les biocapteurs à lipase
III.2. Choix de la lipase
III.3. Les lipases, catalyseurs du monde vivant
III.3.1. Principe général et enjeux
III.3.2. Caractéristiques structurales
III.4. Immobilisation des lipases
Conclusion
Références bibliographiques
Chapitre II : Les pesticides
Les pesticides
II.1. Les pesticides en Algérie : Un usage démesuré
II.2. Contaminants chimiques étudiés
II.2.1 Propriétés physico-chimiques des pesticides étudiés dans ce travail
II.3. La réaction d’hydrolyse de diclofop méthyle
II.4. Contaminants chimiques étudiés (les interférents)
II.4.1. Chlorpyriphos-éthyle
II.4.2. le Chlorothalonil
II.4.3. le paraquat
Conclusion
Références bibliographiques
Chapitre III : Les méthodes analytiques
III.1. Spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS)
III.1.1. Etude de l’interface Métal/Electrolyte
III.1.2. Principe de la spectroscopie d’impédance électrochimique
III.1.3. Présentation graphique de l’impédance
III.1.4. Etude de l’impédance pour un système électrochimique
III.2. La voltamètrie cyclique
III.2.1. Principe
III.3. Mesures conductimétriques
III.3.1. Présentation
III.3.2. Mesure de conductivité
III.3.3. Relation entre la concentration et la conductivité
Conclusion
Références bibliographiques
Chapitre IV : Matériels & méthode
IV.1. Définition des objectifs de la thèse
IV.2. Dispositif électrochimique expérimental
IV.3. Les techniques de caractérisation électrochimique
IV.3.1. La spectroscopie d’impédance électrochimique (SIE)
IV.3.2. La voltammétrie cyclique
IV.3.3. Mesures conductimétriques
IV.4. Dispositifs expérimentaux d’analyse de surface
IV.5. Méthodes et conditions expérimentales
IV.5.1. Enzymes
IV.5.2. Réactifs
IV.5.3. Nettoyage des électrodes de platine
IV.6. Les biocapteurs à lipase 
IV.6.1. Elaboration d’un biocapteur à base de la lipase
IV.6.2. Membranes à base d’albumine de sérum bovin (BSA)
IV.7. Mesure de l’activité enzymatique d’une lipase
IV.7.1. Description du pH-stat
IV.7.2. Travail expérimental
IV.7.3. Modes opératoires
Conclusion
Références bibliographiques
Chapitre V : Résultats & discussion
I. Mesure de l’activité de la lipase de Candida rugosa (CRL)
I.1. Dosage de l’activité de la lipase de Candida rugosa
Conclusion
II. Conditions électriques de fonctionnement optimales pour un biocapteur impédimètrique basé sur la Co-réticulation de la lipase (CRL) par le (GA) en présence de (BSA)
II.1.Caractérisation de la couche enzymatique par la spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS)
II.1.1. Propriétés électriques du film enzymatique à différents potentiels
II.1.2.Modélisation et analyse des diagrammes d’impédance de la couche enzymatique
II.1.3. Essai à blanc
II.1.4. Réponse de biocapteur enzymatique à différents potentiels
II.1.5. Réponses de biocapteurs à -200mv
II.2. Les paramètres influençant sur la réponse de biocapteur enzymatique élaboré
II.2.1. L’effet du pH du milieu
II.2.2. Etude de l’influence de la température
II.3. Caractérisation de la couche enzymatique par la voltamétrie cyclique
II.3.1. Le suivi du processus d’oxydoréduction par voltamétrie cyclique
II.3.2. Effet des vitesses de balayage sur le comportement de l’enzyme immobilisée
II.3.3. Caractérisation de la réponse du biocapteur enzymatique par la voltamètrie cyclique
II.4. Caractérisation de la couche enzymatique par Microscope Optique (MO)
II.5. La détection de polluant organique par un biocapteur enzymatique conductimétrique
Conclusion
III. Etude des interférents de biocapteur impédimétrique à base de la lipase de Candida rugosa (CRL)
III.1. Interférences des ions métalliques
III.2. Interférences des pesticides
Conclusion
IV. Etude de la durée de vie de biocapteur impédimétrique à base de la Lipase de Candida rugosa (CRL)
IV.1. Stabilité du biocapteur
Conclusion
V. Nouveau concept d’un biocapteur impédimètrique à base de la lipase de Pancréas de Porc (LPP)
V.1. Caractérisation par voltamétrie cyclique
V.2. Développement d’une méthodologie d’analyse pour étudier la réponse de biocapteur élaboré
V.3. Caractérisation par mesure d’impédance
V.4. Caractérisation par microscope optique
V.5. Comparaison de la réponse de biocapteur à base de la lipase de Candida rugosa et à base
de la lipase de Pancréas de Porc
Conclusion
Références bibliographiques
Conclusion générale et perspectives

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