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Les multiples rôles de l’activité cytotoxique

Etant donné le rôle de défense du système immunitaire, cette activité cytotoxique a évidemment un rôle bénéfique envers l’organisme par l’élimination des agents pathogènes, la surveillance de processus tumoraux mais aussi pour l’homéostasie des cellules effectrices afin que la réponse immunitaire ne dégénère pas une fois le danger passé. D’un autre côté, si mal contrôlées, ces cellules cytotoxiques peuvent attaquer le soi, entraînant des maladies auto-immunes. Ainsi, j’adresserai ici les rôles de l’activité cytotoxique médiée par les cellules immunitaires précédemment présentées, avec une accentuation particulière sur les acteurs principaux, et les plus étudiés : les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques et les cellules NK.

Défense contre les infections virales, bactériennes et parasitaires

Une réponse immunitaire protectrice contre l’invasion de pathogènes, qu’ils soient d’origines virale, bactérienne ou parasitaire, consiste en un effort concerté d’une multitude de cellules effectrices innées et adaptatives. Ainsi les cellules cytotoxiques vont contribuer à la reconnaissance et l’élimination des cellules infectées de l’organisme. Les populations cellulaires plus connues pour leur activité lytique directe des cellules infectées sont les cellules NK et les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. Les cellules NK entrent en action rapidement, puis une fois l’armée de clones effecteurs CD8+ spécifiques activés, ceux-ci vont complémenter l’action des cellules NK. Les cellules NKT ne sont pas en reste, elles jouent aussi un rôle dans l’élimination de cellules infectées par cytotoxicité directe, dans un contexte d’infections virales32,33,34. Mis à part une activité cytotoxique bien identifiée envers les cellules infectées, la fonction lytique est aussi utilisée contre les cellules immunitaires afin de mener à bien l’infection. En effet, l’activité de lyse des cellules NK joue aussi un rôle dans l’élimination de lymphocytes T régulateurs, afin de moduler leur présence et ainsi leur activité suppressive, dans le contexte d’une infection à mycobacterium tuberculosis35. De plus, les cellules NK sont aussi capables de tempérer la réponse des lymphocytes T par lyse de ces derniers36. En effet, en l’absence de cellules NK, la réponse antivirale est plus rapide et efficace mais cela aboutit à l’émergence d’auto-immunité37. Ainsi en cas d’infection chronique, l’activité de lyse des NK permet aussi de réguler la réponse T afin d’éviter des dommages collatéraux sur les tissus sains.

Activité anti-tumorale

Burnet a été le premier scientifique à émettre le concept d’immuno-surveillance tumorale en 197038. Depuis, il a été largement admis que les mécanismes cytotoxiques exercés à la fois par des cellules immunitaires innées (comme les cellules NK) et des cellules immunitaires adaptatives (comme les CTL) contribuent à l’immunité anti-tumorale en éliminant les cellules du soi transformées ou en créant un environnement local empêchant la croissance tumorale. Cette notion est renforcée par l’observation de souris déficientes pour le gène codant la perforine : en effet, celles-ci développent spontanément des tumeurs avec l’âge, en particulier des lymphomes B39. De même, chez l’Homme, il a été suggéré que des mutations bi- ou mono-alléliques du gène codant la perforine perturbent les mécanismes d’immuno-surveillance basés sur l’activité cytotoxique, favorisant ainsi l’émergence de lymphoproliférations malignes, telles des lymphomes B et T et la maladie de Hodgkin40. Ainsi les cellules lytiques exprimant la perforine, incluant les CTL, les cellules NK, les cellules NKT41 et les Tγδ sont nécessaires dans la surveillance immunitaire anti-tumorale.

Contrôle de l’homéostasie immunitaire

Les lymphocytes T ayant une spécificité antigénique donnée sont présents en un nombre très réduit dans des conditions non pathologiques. En effet, de nombreuses études chez la souris établissent un nombre de lymphocytes T spécifiques d’un antigène compris entre 50 et 100 cellules/rates (définis chez la souris)42–46. En revanche, une fois l’expansion clonale effectuée, une armée de clones effecteurs près à tuer sont formés. Blattman et collaborateurs ont notamment estimé que suite à une infection (LCMV), les lymphocytes T CD8+ subissent plus de 14 divisions en 1 semaine, générant ainsi une population d’environ 10 millions d’effecteurs44. Une fois le pathogène éliminé de l’organisme, les cellules réactives doivent retourner au nombre initial (homéostasie des lymphocytes T) tout en gardant un pool de cellules mémoires. La perforine semble être impliquée dans le processus d’élimination des lymphocytes T CD8+ après une infection aiguë à un pathogène. En effet, les souris déficientes pour la perforine montrent une expansion clonale élevée et une persistance de lymphocytes T spécifiques du virus47. La disparition des cellules effectrices T est essentielle car sa persistance cause le syndrome hémophagocytique résultant d’une activation et d’une prolifération incontrôlées des lymphocytes T, ce qui entraîne une activation excessive des macrophages et de multiples effets délétères48–50. Ce phénomène, aussi appelé phase de contraction, implique également la mort induite par l’activation (AICD) ou par les récepteurs de mort comme Fas. Ces notions seront évoquées dans le chapitre II. D’autres hypothèses de régulation ont été avancées, comme l’infection des lymphocytes T eux-mêmes qui mènerait à la lyse fratricide. En effet, certains virus lymphotropiques (ex CMV, HTLV-1) infectent naturellement les lymphocytes T CD8+ 51. Un autre mécanisme consisterait en l’acquisition, par transfert suite à ses actions de lyse directe, d’une forte quantité de complexes p-CMH à la surface du lymphocytes T CD8+, permettant ainsi la diminution de la réponse CTL par fratricide52,53. Enfin, de manière indirecte, l’élimination perforine-dépendante des APC agirait comme un mécanisme régulateur afin d’empêcher l’accès des APC au nœud lymphatique et l’activation de lymphocytes T spécifiques additionnels54. Par ailleurs, les CTL ne sont pas les seuls à participer à leur propre homéostasie cellulaire, il a aussi été démontré plus récemment que les cellules NK participaient au contrôle de l’homéostasie des CTL dans le cadre d’une infection pour prévenir du développement du syndrome hémophagocytique55. Ainsi, en plus d’une activité sécrétoire cytotoxique essentielle pour éliminer les cellules infectées ou tumorales, les cellules cytotoxiques NK et CTL sont capables d’utiliser cette sécrétion lytique afin de réguler l’homéostasie immunitaire, supplémentant les mécanismes non-sécrétoires comme Fas48,56,57.

Implication dans les réponses auto-immunes

En contrepartie de leur rôle protecteur, les cellules cytotoxiques sont parfois aussi impliquées dans le déclenchement de maladies auto-immunes. Cela a été clairement démontré dans des modèles de souris de diabète spontané ou d’encéphalomyélite expérimentale (EAE). En effet, malgré une infiltration lymphocytaire au niveau du pancréas, la déficience en perforine éliminait, ou diminuait fortement, la sévérité de la réponse auto-immune envers les cellules β du pancréas58,59. Dans la pathogénicité de la sclérose en plaque et l’EAE, plusieurs populations cytotoxiques sont impliquées : les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques29, mais aussi les lymphocytes T CD4+ cytotoxiques30, ainsi que les cellules NK principalement responsables de la destruction des tissus60.
D’autre part, dans le contexte de la mise en place d’une maladie auto-immune, la fonction cytotoxique des différentes populations immunitaires n’est pas seulement pathogénique, elle joue aussi un rôle dans la régulation des cellules pathogéniques. Comme introduit précédemment, les lymphocytes T régulateurs peuvent avoir une fonction cytotoxique mais la part de celle-ci dans l’auto-immunité n’a pas encore été étudiée. En revanche, il a été démontré que les lymphocytes T CD8+ possèdent aussi une activité régulatrice, par leur fonction cytotoxique sur les lymphocytes T CD4+ auto-réactifs, dans le cadre de la sclérose en plaque61,62. De même, les cellules NK ont aussi une activité régulatrice, notamment dans l’EAE, par une activité lytique dirigée contre les lymphocytes T auto-réactifs et les APC60.
En conclusion, parmi les différents contextes pathologiques auxquels est confronté notre organisme (infections, tumeurs et auto-immunité), ainsi que pour l’homéostasie cellulaire, la fonction cytotoxique est majoritairement bénéfique.

Aspects fondamentaux des lymphocytes T cytotoxiques (classiques et non classiques)

La fonction des CTL a longtemps été étudiée comme une propriété exclusivement effectuée par la population de lymphocytes T CD8+. Cependant, des sous-populations de lymphocytes T CD4+ aux capacités cytotoxiques ont également été identifiées. J’ai donc choisi de présenter dans ce chapitre ces deux populations de lymphocytes T cytotoxiques ayant un TCR, dit « conventionnel » : αβ.

Activation et différenciation des lymphocytes T cytotoxiques

Avant d’aborder l’activation et la différenciation des lymphocytes T en cellules cytotoxiques, je souhaite faire un bref rappel sur le développement de ces lymphocytes T.
Les progéniteurs lymphoïdes, issus de la cellule souche hématopoïétique, vont quitter la moelle osseuse afin de pénétrer dans le thymus et y poursuivre leur différenciation. Les cellules en différenciation dans le thymus, aussi appelés thymocytes, subiront une sélection positive et une sélection négative qui permettront de s’assurer que les lymphocytes T qui sortiront du thymus : seront, premièrement, capables de reconnaître les cellules présentatrices de l’antigène et deuxièmement, ne réagiront pas contre le soi. À la sortie du thymus, les lymphocytes T qui sont alors naïfs (n’ayant jamais rencontrés l’antigène dont ils sont spécifiques) vont gagner, via la circulation sanguine, les organes lymphoïdes secondaires. Ces sites favorisent la rencontre entre les lymphocytes T et les antigènes provenant de pathogènes présentés à la surface des cellules présentatrices de l’antigène, en condition pathologique. En absence d’interaction antigénique spécifique, les lymphocytes T naïfs vont circuler entre les différents organes lymphoïdes secondaires.

Les lymphocytes T CD8+

Les lymphocytes T CD8+ constituent une branche puissante du système immunitaire adaptatif, permettant une éradication spécifique de cellules infectées ou encore de cellules tumorales. Dès 1975, l’importance de la fonction cytotoxique médiée par des cellules a été démontrée par la déplétion des lymphocytes exprimant CD8α et CD8β par des anticorps63–65. Par la suite, la restriction au CMH de classe I pour leur sélection, activation et fonction a été identifiée66.
Les lymphocytes T CD8+ naïfs ne sont pas encore armés pour exercer leur activité effectrice. Ce n’est qu’au contact de cellules présentatrices d’antigènes et à l’aide de lymphocytes T CD4+ Th1 via les cytokines IL-2 et IFNγ67 ou l’interaction CD40/CD40L68, que les lymphocytes T CD8+ s’activent pour produire les molécules effectrices telles que les molécules lytiques69, les cytokines ou encore les récepteurs de mort. S’en suit une expansion clonale. Cette expansion est conduite par des quantités importantes d’IL-2 produites par les lymphocytes T eux-mêmes. L’IL-2 fonctionne alors dans un mode autocrine et paracrine en se fixant sur le récepteur à l’IL-2, celui-ci étant sur-exprimé lors de l’activation.
Par ailleurs, suite à l’activation d’un lymphocyte T naïf, une génération d’une multitude de sous-populations ayant différents phénotypes et propriétés fonctionnelles est mise en place. Un modèle linéaire et progressif de différenciation a alors été proposé sur la base de l’expression de CCR7, CD45RA et CD45RO (Figure 4).
Les lymphocytes T naïfs (TN) expriment l’isoforme CD45RA, CD62L et CCR7, permettant leur circulation mais aussi l’entrée dans les organes lymphoïdes secondaires71. Le signal TCR lors de la reconnaissance de l’antigène présenté par l’APC, mais aussi des signaux de co-stimulation, sont intégrés par le lymphocyte T afin d’initier le programme de prolifération et de différenciation. Une première étape de différenciation est le changement d’isoforme de CD45 en CD45RO72. Parmi les deux sous-populations exprimant CD45RO, l’une correspond aux lymphocytes T centraux mémoires (TCM) exprimant CCR7, tandis que l’autre perd l’expression de celui-ci et correspond aux lymphocytes T effecteurs mémoires (TEM)73. Du côté fonctionnel, cette différence phénotypique permet aux TCM et TEM de patrouiller à la recherche de cibles au niveau des organes lymphoïdes et des tissus périphériques, respectivement74. Enfin, au bout de la chaîne de différenciation se trouve les lymphocytes T effecteurs (TEFF) à courte durée de vie en grande quantité. Plus récemment, l’identification d’une nouvelle sous-population a été décrite, il s’agit des lymphocytes T mémoires de type cellule souche (TSCM). En effet, ces cellules ont la capacité de se renouveler ainsi que la possibilité de générer toutes les sous-populations mémoires et effectrices75. Par ces capacités et leur phénotype proche des cellules naïves, le modèle de différenciation débute à partir des TN qui se différencient en TSCM, puis TCM et TEM pour finir en TEFF (Figure 5).
Ce modèle progressif s’est enrichi au fur et à mesure de l’identification de nouveaux marqueurs permettant l’identification de nouvelles sous-populations ou la proposition de nouveaux modèles. Le modèle retenant mon attention est une différenciation des lymphocytes T CD8+ naïfs à la fois en cellules effectrices CTL et en TSCM. Les TSCM enclenchent les voies de différenciations des différents types de cellules mémoires, mais ces voies ne sont pas complétement linéaires avec un retour possible des CTL vers TSCM. Il est aussi possible que des T en transition (TTM) peuvent se différencier en CTL sans passer par TEM76.
Enfin, cette armée de lymphocytes T CD8+ effecteurs antigène-spécifiques, ayant acquis l’expression des molécules lytiques, quitte le tissu lymphoïde pour migrer sur le site de l’inflammation. Ainsi les CTL peuvent alors tuer les cellules altérées en dégranulant leurs molécules lytiques de manière polarisée77,78 ou par fixation de récepteurs de mort exprimés à la surface des cellules cibles et/ou par la sécrétion de cytokines ayant des actions antivirales et anti-tumorales. Ces différentes voies de cytotoxicité possibles seront décrites plus en détails dans la partie II.2 portant sur les fonctions effectrices des lymphocytes T cytotoxiques.
Une fois l’inflammation controlée, un phénomène de contraction opère afin de retrouver un nombre basal de lymphocytes T CD8+, tout en gardant un pool de cellules mémoires afin que le système immunitaire soir réactif en cas de réponse secondaire au pathogène en question.

Les lymphocytes T CD4+

Les lymphocytes T CD4+ ont initialement été décrits comme ayant essentiellement un rôle de « helpers ». Puis des sous-populations de lymphocytes T CD4+ « régulateurs » ont été découvertes. Même si prépondérantes parmi l’ensemble des lymphocytes T CD4+, et fortement décrites dans la littérature, une sous-population de lymphocytes T CD4+ possède aussi une fonction cytotoxique. En effet, l’identification de lymphocytes T CD4+ dotés d’un potentiel cytotoxique direct, dans un contexte antigénique CMH de classe II restreint, remonte aux années 197079. Tout d’abord, cette fonctionnalité a été considérée comme un artefact, les clones CD4+ à activité lytique étant issus d’une culture in vitro à long terme80 ou générés in vivo chez des souris déficientes en CD881. Par la suite, l’identification de CD4 CTL ex vivo dans le sang périphérique de patients infectés de manière chronique par des virus divers tels que le cytomegalovirus (CMV), le virus d’Epstein Barr (EBV) ou le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) a prouvé l’existence de ces cellules dans l’organisme82–84. La présence de ces dernières a été également mise en évidence dans d’autres pathologies, dans certaines infections bactériennes85, dans des maladies inflammatoires et également des pathologies auto-immunes86. Enfin, l’activité cytotoxique de lymphocytes T CD4+ a aussi été démontrée envers des cellules tumorales (mélanome) exprimant le CMH de classe II87. Ainsi la génération de cette population ne semble pas liée à un type de maladie mais à la chronicité de celle-ci. En effet, ces CD4 CTL sont décrits comme présentant un phénotype de cellules « terminalement » différenciées, ce qui est caractéristique d’une stimulation antigénique prolongée. Concernant la différenciation de ces lymphocytes T CD4+, plusieurs études ont révélé des origines variées. Vraisemblablement, les CD4 CTL peuvent se développer à partir de Th088,89, Th190,91, Th292, Th1793, et Treg94. Néanmoins, les CD4 CTL dérivés de Th1 représentent la plus grande majorité des CD4 CTL. Afin d’éclairer l’origine des CD4 CTL, une étude récente a identifié la molécule CRTAM comme étant un marqueur précoce de cette population95. Après stimulation de lymphocytes T CD4+ naïfs, les auteurs ont purifié la population CRTAM+ et l’ont caractérisée comme étant capable de sécréter de l’IFNγ mais aussi granzyme B et perforine. De plus, ces cellules présentent une activité cytotoxique, ce sont donc des CD4 CTL. Malheureusement, l’expression de CRTAM est transitoire et à ce jour aucun marqueur spécifique des CD4 CTL n’a été identifié. Les auteurs ont ainsi proposé un modèle de différenciation des CD4 CTL dans une revue (Figure 6).
Dans l’ensemble, les mécanismes de lyse des lymphocytes T CD4+ cytotoxiques semblent fortement similaires à ceux des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques. En revanche, comparés aux CD8 CTL, les CD4 CTL présentent un délai dans leur activité de lyse avec une efficacité sur des temps plus long97. Ainsi, dans le cas de cellules altérées exprimant le CMH de classe II, les CD4 CTL vont pouvoir supplémenter l’action cytotoxique des CD8 CTL. Ils pourraient même agir comme une « roue de secours » en cas d’un défaut de mise en place ou d’activité des CD8 CTL.

Fonctions effectrices des lymphocytes T cytotoxiques

Les outils pour éliminer les cellules cibles sont multiples avec une possibilité de tuer par contact direct (la synapse lytique) ou indirect (les cytokines). Toutefois l’arme principale utilisée par les CTL est le contact direct avec la délivrance des granules contenant les molécules lytiques.

La synapse lytique

La synapse lytique est une synapse immunologique spécialisée dans la fonction cytotoxique. La synapse immunologique a fortement été étudiée pour le contact entre un lymphocyte T et une cellule présentatrice de l’antigène (APC), ce qui a permis de définir son architecture. Ainsi cette synapse est caractérisée par une structure en forme d’œil avec au centre le c-SMAC puis en périphérie le p-SMAC et enfin le d-SMAC (figure 7)98–100. Les composants majeurs du c-SMAC sont les molécules clefs pour la reconnaissance et l’activation des lymphocytes T, comme l’interaction TCR/CD3 avec le complexe peptide/CMH, et le co-récepteur CD28 ou CTLA4 avec CD80/CD86. En revanche, le p-SMAC est composé de molécules d’adhésion permettant le maintien de la structure de la synapse, avec par exemple LFA-1 interagissant avec ICAM-1 et CD2 avec CD48/CD58. Le d-SMAC est défini comme étant une région enrichie en molécules possédant des domaines extracellulaires très longs, comme CD45101 et CD43102. Il a été déterminé que l’alignement de ces récepteurs est initialement dû à la taille de leur ecto-domaine, supporté par le modèle de ségrégation103. Ainsi le concept général de l’organisation synaptique est que le c-SMAC permet la reconnaissance de l’APC suivie par l’activation du lymphocyte T, tandis que le p-SMAC et le d-SMAC permettent la conjugaison T-APC et la stabilisation de l’architecture de la synapse immunologique.
Représentation schématique des principaux composants clefs de la structure de la synapse immunologique dans le c-SMAC (vert intense), le p-SMAC (vert) et le d-SMAC. Adapté de Yokosuka T. et Saito T.
Toutefois, la structure de la synapse lytique formée par les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques n’est pas complètement similaire à la synapse immunologique formée par les lymphocytes T CD4+. En effet, il a été démontré qu’à la synapse entre un lymphocyte T CD8+ cytotoxique et sa cible, deux domaines distincts sont formés : un domaine de signalisation (correspondant au c-SMAC) et un domaine sécrétoire où convergent le centre organisateur des microtubules (MTOC) et les granules lytiques77.
En outre, l’équipe de Griffiths a récemment démontré un rôle clef de la dynamique du cytosquelette d’actine dans la synapse lytique. Dans un premier temps, un fort enrichissement de l’actine corticale est observé au contact de la cible, puis très rapidement, une « déplétion » de l’actine au centre de la zone de contact est effectuée afin de permettre le docking du MTOC et le passage des granules lytiques pour leur exocytose104. Effectivement, il a été démontré, pour les cellules NK, que les granules lytiques présents au niveau de l’aire synaptique passaient au travers des mailles du cytosquelette d’actine105.

Table des matières

INTRODUCTION
I. LE SYSTEME IMMUNITAIRE ET SON ARME DE DEFENSE MASSIVE : L’ACTIVITE CYTOTOXIQUE
I.1. Vue générale du système immunitaire et présentation des acteurs cellulaires aux capacités
cytotoxiques
I.1.a Les principaux acteurs :
I.1.b Les acteurs moins populaires :
I.1.c Les nouveaux :
I.2. Les multiples rôles de l’activité cytotoxique
I.2.a Défense contre les infections virales, bactériennes et parasitaires
I.2.b Activité anti-tumorale
I.2.c Contrôle de l’homéostasie immunitaire
I.2.d Implication dans les réponses auto-immunes
II. ASPECTS FONDAMENTAUX DES LYMPHOCYTES T CYTOTOXIQUES (CLASSIQUES ET NON CLASSIQUES)
II.1. Activation et différenciation des lymphocytes T cytotoxiques
II.1.a Les lymphocytes T CD8+
II.1.b Les lymphocytes T CD4+
II.2. Fonctions effectrices des lymphocytes T cytotoxiques
II.2.b La synapse lytique
II.2.a Les granules lytiques
II.2.c Les cytokines
II.2.d Les voies alternatives de l’activité cytotoxique
II.3. Questions ouvertes
III. DEFAUT D’ACTIVITE CYTOTOXIQUE DANS LE CONTEXTE DU SYNDROME DE WISKOTT-ALDRICH
III.1. Le syndrome de Wiskott-Aldrich
III.1.a Impact sur le système immunitaire inné
III.1.b Impact sur le système immunitaire adaptatif
III.2. Défauts d’activité cytotoxique (NK et CTL)
III.2.a Les cellules NK
III.2.b Les CTL
III.3. Questions ouvertes
III.3.a Stabilité de la synapse
III.3.b Activation de l’intégrine LFA-1
IV. ACTIVITE CYTOTOXIQUE DES LYMPHOCYTES T REGULATEURS : APPLICATION THERAPEUTIQUE
IV.1. Vue générale des thérapies cellulaires à base de lymphocytes T
IV.1.a Thérapie cellulaire anti-tumorale
IV.1.b Thérapie cellulaire anti-inflammatoire
IV.2. Thérapie cellulaire Ovasave®
IV.2.a Démarche de développement thérapeutique de l’entreprise TxCell
IV.2.b Ovasave® : un produit thérapeutique ciblé pour la maladie de Crohn
IV.3 Hypothèses de travail sur le mécanisme d’action des Tr1 Ovasave®
IV.3.a Activité suppressives « classiques »
IV.3.b Activité cytotoxique
OBJECTIFS
RESULTATS
PARTIE 1. HETEROGENEITE INDIVIDUELLE INTRA-CLONALE DE LYMPHOCYTES T CD8+ CYTOTOXIQUES LORS D’UNE ACTIVITE DE LYSE SOUTENUE
Discussion et perspectives (partie 1)
PARTIE 2. LA PROTEINE DU SYNDROME DE WISKOTT-ALDRICH CONTROLE LE RING DE NANOCLUSTERS DE LFA-
1 A LA SYNAPSE LYTIQUE
Discussion et perspectives (partie 2)
PARTIE 3. LES LYMPHOCYTES T REGULATEURS OVASAVE® SONT DOTES D’UNE ACTIVITE CYTOTOXIQUE
ALTERNATIVE VIA LA GRANULYSINE ET LES GRANZYMES
Discussion et perspectives (partie 3)
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

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