HISTORIQUE DES CORONAVIRUS HUMAINS

Le premier coronavirus humain (HCoV) a été isolé en 1965 à partir de l’écoulement nasal d’un patient et a été nommé B814 [1]. Puis deux autres espèces ont été isolées à la fin des années 1960 : les coronavirus 229E (HCoV-229E) et OC43 (HCoV-OC43) par des équipes de recherches américaines [2,3]. Ces virus sont impliqués dans 15 à 29% des rhumes [4] et sont responsables d’infections respiratoires souvent bénignes (fièvre, toux, céphalées, rhinorrhées).
C’est en 2003 qu’émerge le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV) dans le delta de la rivière des perles à Guangdong en Chine [5]. L’épidémie liée à ce virus est reconnue officiellement suite aux cas dans et autour de l’hôpital Prince of Wales de Hong Kong le 10 mars 2003 [6]. Les signes cliniques les plus fréquemment rapportés sont la fièvre et un syndrome pseudo-grippal associés à des troubles respiratoires et dans de plus rares cas à des troubles gastro-intestinaux. L’évolution des contaminations dans le monde est croissante jusqu’en juillet 2003, puis se stabilise avant de diminuer. Le SARS-CoV est responsable d’une épidémie qui a touché 29 pays entre novembre 2002 et juillet 2003 avec 8098 patients infectés pour 774 décès.
Les coronavirus humains NL63 (HCoV-NL63) et HKU1 (HCoV-HKU1) sont ensuite décrits respectivement en 2004 et 2005 [7,8]. Ils sont aussi responsables de rhumes avec des symptômes tels que rhinorrhées, toux, et fièvre. En septembre 2012, un sixième coronavirus humain émerge au Moyen Orient : le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) [9]. Il a été isolé des poumons d’un homme de 60 ans décédé à la suite d’une insuffisance respiratoire sévère en Arabie Saoudite à Jeddah. Les signes cliniques sont assez variés : ils vont de la pneumonie non sévère à l’insuffisance respiratoire sévère avec choc septique et insuffisance rénale pouvant conduire au décès [10].

TAXONOMIE

La classification actuelle des coronavirus comprend 39 espèces réparties dans cinq genres, 27 sous-genres, et deux sous-familles appartenant à la famille Coronaviridae, au sous-ordre
Cornidovirineae, à l’ordre Nidovirales et au royaume Riboviria. Les sept coronavirus humains pathogènes pour l’homme appartiennent à deux sous-groupes différents : d’une part celui des alphacoronavirus regroupant les HCoV-229E et HCoV-NL63 et d’autre part celui des betacoronavirus regroupant le SAR-CoV, les HCoV-HKU1 et HCoV-OC43, le MERS-CoV et le SARS CoV-2.
Le SARS-CoV-2 appartient au sous-genre Sarbecovirus et a l’espèce Severe acute respiratory syndrome related coronavirus (SARSr-CoV) qui comprend également le SARS-CoV. Du fait de sa grande proximité génétique avec le SARS-CoV, l’ICTV (Comité International de Taxonomie des Virus) l’a nommé SARS-CoV-2 le 11 février 2020 [13].

PROPRIETES STRUCTURALES

Le SARS-CoV-2 est un virus à ARN simple brin non segmenté de polarité positive (29 903 nucléotides) ce qui en fait l’un des virus à ARN avec le plus long génome capable d’infecter l’Homme.
Il comprend 4 protéines structurales majeures :
 la protéine Spike (S) : glycoprotéine à la surface du virus qui comprend deux sousunités (S1 et S2). La sous-unité S2 est impliquée dans l’attachement du virus à son récepteur Enzyme de conversion de l’angiotensine de type II (ACE2) via le domaine de liaison au récepteur (Receptor Binding Domain (RBD)) [15]. Elle permet la liaison du virus aux cellules cibles (cellules respiratoires essentiellement) et provoque la fusion cellulaire. Elle induit des anticorps neutralisants.
La glycoprotéine d’enveloppe (E) : glycoprotéine transmembranaire, impliquée dans l’assemblage et la maturation virale [16].
 la glycoprotéine membranaire (M) : glycoprotéine de surface, impliquée dans l’assemblage des virions [17].
 la protéine de la nucléocapside (N) : protéine liée à l’ARN viral qui participe à son entrée dans la cellule hôte et à l’assemblage des virions.

CYCLE VIRAL

L’entrée du virus se fait via l’interaction entre le domaine RBD de la protéine Spike et son récepteur ACE2 au niveau de différents tissus (muqueuse nasale, nasopharynx, poumons, estomac, moelle osseuse, rate, reins, foie et cerveau) pouvant ainsi expliquer les signes cliniques variés [20]. L’entrée peut se faire de deux manières : via le récepteur TMPRSS2 (entrée par fusion) ou via la clathrine (entrée par endocytose), présents à la surface cellulaire. Une fois dans le cytosol, l’ARN viral est traduit (après élimination de la protéine N) directement par les ribosomes de la cellule (du fait de sa polarité positive) en polyprotéines pp1a et pp1ab avec libération des protéines 3CL-pro et PL-pro.
Commence alors la réplication virale après assemblage du complexe de réplicationtranscription avec formation des ARN sous-génomiques qui seront ensuite traduits pour former les protéines structurales S, E et M. La protéine N est formée dans le cytosol puis bourgeonne dans le compartiment intermédiaire du réticulum endoplasmique-appareil de Golgi (ERGIC) où elle s’assemble avec les autres protéines structurales avant libération des nouveaux virions matures et infectieux par exocytose [21].

CYCLE VIRAL

L’entrée du virus se fait via l’interaction entre le domaine RBD de la protéine Spike et son récepteur ACE2 au niveau de différents tissus (muqueuse nasale, nasopharynx, poumons, estomac, moelle osseuse, rate, reins, foie et cerveau) pouvant ainsi expliquer les signes cliniques variés [20]. L’entrée peut se faire de deux manières : via le récepteur TMPRSS2 (entrée par fusion) ou via la clathrine (entrée par endocytose), présents à la surface cellulaire.
Une fois dans le cytosol, l’ARN viral est traduit (après élimination de la protéine N) directement par les ribosomes de la cellule (du fait de sa polarité positive) en polyprotéines pp1a et pp1ab avec libération des protéines 3CL-pro et PL-pro.
Commence alors la réplication virale après assemblage du complexe de réplicationtranscription avec formation des ARN sous-génomiques qui seront ensuite traduits pour former les protéines structurales S, E et M. La protéine N est formée dans le cytosol puis bourgeonne dans le compartiment intermédiaire du réticulum endoplasmique-appareil de Golgi (ERGIC) où elle s’assemble avec les autres protéines structurales avant libération des nouveaux virions matures et infectieux par exocytose [21].

SIGNES CLINIQUES ET COMPLICATIONS

Les signes cliniques initiaux de la COVID-19 consistent souvent en ceux d’autres infections virales respiratoires à savoir de la fièvre, une toux souvent sèche, accompagnés de myalgies et plus rarement de rhinorrhées, de maux de gorge, de douleurs thoraciques ou de diarrhées/vomissements [23,24]. Une anosmie et une agueusie sont souvent rapportées par les patients [25]. Des manifestations cutanées à types d’éruption ou lésions érythémateuses ont été décrits (surtout dans les formes bégnines de la maladie) [26].
Les syndromes de détresses respiratoires aiguës, les surinfections bactériennes et les thromboses sont les complications les plus fréquentes et sont associés à l’hospitalisation en unité de réanimation.
Un âge avancé (>65 ans) et de nombreuses comorbidités ont été listées comme facteurs de risque des formes cliniques sévères (diabète, obésité, maladies cardio-vasculaires, hypertension) [27].

Diagnostic direct

RT-PCR en temps réel

La RT-PCR en temps réel a été développée dès la disponibilité du génome viral (11 janvier 2020) afin de le mettre en évidence par amplification et hybridation moléculaires. Il s’agit de la technique de référence pour diagnostiquer les infections à SARS-CoV-2. Cette technique consiste à amplifier la séquence connue d’un fragment du génome du SARSCoV- 2 en la ciblant par deux amorces et une sonde d’hydrolyse marquée par un fluorochrome.

Détection d’antigène viral par technique immuno-chromatographique

Les tests rapides d’orientation diagnostique (TROD) ont été développés afin de compléter le diagnostic du SARS-CoV-2 dans les cabinets médicaux ou les pharmacies d’officines. Ils détectent par principe immuno-chromatographique les protéines (antigènes) du SARS-CoV-2 à partir d’un prélèvement nasal ou naso-pharyngé.
Ce sont des tests simples d’utilisation pouvant même être réalisés par le patient (auto-test) avec des résultats rapides obtenus en moins de 30 minutes. Avec une sensibilité moindre que celle de la RT-PCR, les résultats (surtout ceux négatifs) doivent être confirmés par une technique de référence selon l’indication et la situation clinique.

Culture cellulaire

A l’institut hospitalo-universitaire (IHU) Méditerranée Infection, depuis le début de la pandémie nous avons inoculé en culture dans le laboratoire NSB3 près de 9000 échantillons positifs en RT-PCR pour le SARS-CoV-2. Nous avons testé différentes lignées cellulaires [28] et avons retenu les cellules Vero E6, cellules de reins de singes verts Africains pour l’isolement du SARS-CoV-2 en routine. Brièvement, 500 μl de l’échantillon de départ (frais ou stocké à +4°C, -20°C ou -80°C) ont été filtrés à 0,22 μm (Merck Millipore, Darmstadt, Allemagne) puis inoculés sur des plaques 96 puits contenant des cellules Vero E6 dans du milieu de culture (Minimum Essential Medium) avec 4% de sérum de veau foetal et 1% de glutamine. Ensuite, les plaques ont été incubées à 37°C sous 5% de CO2 après une centrifugation à 4000 g. L’effet cytopathogène a été observé quotidiennement.
La figure 6 montre des cellules Vero E6 non infectées (figure 6c) et des cellules Vero E6 infectées par le SARS-CoV-2 48h post-inoculation.

Séquençage

Le séquençage de nouvelle génération (NGS) ou séquençage à haut débit est une technologie développée depuis le début du 21ème siècle et d’introduction récente dans les laboratoires demicrobiologie et virologie clinique, qui permet de séquencer l’ADN ou l’ARN beaucoup plus rapidement que les méthodes précédentes comme le séquençage par la technologie Sanger. Dèsjuillet 2020, le NGS a permis d’observer une grande diversité entre les souches de SARS-CoV- 2 parmi les cas diagnostiqués à l’IHU Méditerranée Infection avec la mise en évidence de plusieurs variants [30], démontrant l’intérêt d’une surveillance épidémiologique génomique. A ce jour (au 13 septembre 2021) ont par exemple été identifiés 2764 patients positifs au variant communément appelé Marseille-4 (20A.EU2 selon la classification Nextstrain), 3622 patients positifs au variant alpha, 221 patients positifs au variant beta et 2859 patients positifs au variant delta.

Diagnostic indirect sérologique

La détection d’anticorps anti-SARS-CoV-2 par techniques sérologiques n’est pas utilisée pour le diagnostic d’infection mais pour la détermination du statut immunitaire du patient vis-à-vis du SARS-CoV-2, un résultat positif indiquant une infection ancienne ou en cours et/ou une vaccination. Sont détectés des anticorps post-infectieux IgG anti-SARS-CoV-2 (dirigés contre la protéine N) ou post infectieux et/ou post-vaccinaux (dirigés contre la protéine S) par technique immuno-enzymatique ELISA. Il existe aussi des tests rapides à lecture subjective permettant la détection des IgM et/ou IgG anti SARS-CoV-2.