Le processus d’éjection de l’ADN

L’infection à travers

Dans les chapitres 8 et 10 nous avons étudié le processus d’éjection de l’ADN in vitro provoqué par l’interaction du phage avec son récepteur membranaire purifié sous forme soluble. L’interaction entre le phage et son récepteur se produit donc dans un environnement différent de celui rencontré in vivo où la protéine est insérée dans la membrane externe d’E. Coli. Sans aller jusqu’à recréer un environnement aussi complexe que celui rencontré in vivo par T5, nous allons complexifier notre système in vitro en suivant le passage de l’ADN à travers une bicouche lipidiquecontenant FhuA [100, 67, 66, 11]. Dans un registre différent, deux études d’électrophysiologie réalisées sur des membranes lipidiques planaires ont permis de montrer que, mis séparément, ni FhuA ni T5 ne créent de pores à travers la bicouche. Or, si des phages T5 sont ajoutés sur une membrane lipidique contenant FhuA, des pores de haute conductance (0.1nS à 1nS dans une solution à 100mM KCl) se forment, prouvant l’action combinée de T5 sur FhuA [12, 127].canisme évoqué plus haut. Les études de cryo EM montrentque l’ADN est transféré dans les protéoliposomes contenant FhuA. Les études d’électrophysi- ologie confirment la formation un pore à travers la membrane ; il est raisonnable de penser que l’ADN de T5 traverse la membrane via ce pore. Des questions restent posées sur ce mé- canisme : à quel moment ce pore est-il formé ? Lors de la fixation du phage sur FhuA ? Lors de l’éjection de l’ADN, après l’étape d’activation ? Ou bien entre ces deux évènements ? Imagi-nons qu’un tel pore s’ouvre dans la bicouche lipidique et que l’ADN passe à travers ce pore. A cause de la présence de l’ADN, on s’attend à ce que le pore se bouche transitoirement, donc à une réduction du courant électrique. Comment expliquer que les études précédentes ne fassent pas état de telles fermetures transitoires.

Objectifs

En outre, ce montage doit permettre de répondre à d’autres questions : la cinétique d’éjection est-elle la même en solution et à travers une membrane ? Peut-on reconstituer l’éjection caractéristique in vivo en 2 étapes (voir partie 7.5.2) ? Peut-on mimer la membrane externe en co-reconstituant la protéine avec des lipides et du lipopolysaccharide (LPS) et observer un effet sur la cinétique de fixation de T5 ?Ce projet a été effectué essentiellement pendant les 6 derniers mois de la thèse. Nous présentons dans cette partie les résultats expérimentaux qui concernent la mise au point du système d’éjection en membrane et du montage expérimental. Je désigne par vésicules unilamellaires, des membranes lipidiques fermées (≈ sphériques) constituées d’une seule bicouche. Ces vésicules sont classées selon leur taille. Les ”petites“ vésicules unilamellaires (SUVs pour small unilamellar vesicles) ont un diamètre compris entre 40 et 100 nm. Les vésicules unilamellaires ”géantes“ (GUVs pour giant unilamellar vesicles) ont un diamètre compris entre 2 et 100 µm ; étant donnée leur grande taille, ces dernières sont particulièrement adaptées à la microscopie de fluorescence. Les membranes lipidiques planes sont ouvertes. Elles sont attachées et donc délimitées par un orifice de taille micrométrique (de 1 à 200µm) qui sépare deux compartiments appelés cis et trans. Par l’ajout d’électrodes, le courant électrique passant à travers cette membrane peut être mesuré. De telles membranes sont généralement peintes sur l’orifice (BLMs pour black lipid membranes), comme celles que nous utilisons dans les expériences de translocation d’ADN à travers l’alpha hémolysine.

L’idée la plus naturelle pour réaliser une expérience combinant optique et électrophysiologie aurait été de se baser sur le montage utilisé pour la translocation de molécules d’ADN à travers le pore de l’alpha hémolysine et qui permet d’observer la membrane lipidique tout en mesurant le courant électrique à travers le pore (voir 13.4). Cependant, tous nos essais furent infructueux. Voici un résumé des problèmes rencontrés : Les membranes lipidiques peintes (BLMs) ne peuvent être formées avec des protéines. Il faut insérer FhuA après la formation de la bicouche. Or, la solution stock de FhuA contient du détergent. Le détergent permet de maintenir l’activité de FhuA mais il risque aussi de déstabiliser la bicouche. On ne peut donc pas se contenter d’ajouter la protéine en solution et d’attendre son insertion comme pour l’alpha hémolysine. Il est nécessaire d’effectuer une étape intermédiaire de reconstitution de FhuA dans de petits protéoliposomes, qui seront alors fusionnés avec la membrane peinte. La reconstitution de FhuA dans les petits protéoliposomes est relativement aisée (voir protocole 15.5.1), mais la fusion de ces protéoliposomes avec la membrane n’est pas facile. Déférentes ”ingrédients“, comme l’ajout de calcium dans la solution tampon, l’application d’une déférence de pression osmotique de part et d’autre de la membrane couplée à l’agitation de la solution dans les compartiments cis et transfont partie de la recette pour faciliter les fusions. Mais FhuA n’est pas un pore ! Aucune activité n’est décelable pendant ces éventuelles fusions. Il faut ajouter T5 avant d’espérer obtenir des signaux électriques d’ouverture de canaux. Parmi nos essais, nous avons bien observé quelques signaux électriques, mais ils n’étaient pas suffisamment reproductibles, et ils étaient non corrélés à des signaux de fluorescence. Il était donc impossible d’en tirer des conclusions satisfaisantes.