MATERIEL ET METHODES

MATERIEL

Lieu de prélèvement

Le prélèvement des échantillons a été effectué à l’UTL de Nguékokh, près de Mbour à 83km de Dakar.
L’UTL est constituée d’une aire de réception couverte et de deux chambres. La première chambre sert de traitement du lait et la deuxième est utilisée pour garder le matériel et le sucre.

Produits analysés

Les études faites ont porté sur :
– le lait cru
– les laits caillés (2 à 3 sachets de 1/4 de litre représentent 1 échantillon et chaque échantillon correspond à une production journalière).
Sur chaque type de lait (cru et caillés), 100échantillons sont analysés.
Matériel de prélèvement et de mesure des paramètres physicochimiques et enzymatiques sur le terrain.
Il comprend :
– une glacière contenant 3 à 4 outres de CO2 ou carboglaces congelées, pour le transport des échantillons de laits caillés sous régime froid ;
– la verrerie : tubes à essais, boîtes de Pétri, béchers, pipettes, éprouvette, burette suspendue à une potence, pots pour prélever le lait ;
– papier buvard, lactodensimètre, thermomètre, papier pH ;
– réactifs : lessive de soude (N/9), phénolphtaléine à 1% (dans de l’alcool 95%), alcool éthylique à 68%, H2O2, bleu de méthylène à 5%.

Matériel de laboratoire

Il s’agit du matériel habituel des laboratoires de microbiologie alimentaire composé de :
– matériel de stérilisation : four pasteur, bec bunsen, autoclave ;
– matériel de pesée : balance de précision ;
– matériel de broyage et d’homogénéisation : broyeur type « STOMACHERND » ;
– matériel divers : tubes à essais, flacons de 250, 500, 1000 et 2000ml, boîtes de Pétri, pipettes, étaleur en verre, béchers, ciseaux, port-tubes, paniers, sachets stomacher ;
– réfrigérateur, bain-marie pour la régénération des milieux de culture.
– Une burette suspendue à une potence, un pH mètre, un vortex ou agitateur de tubes ;
– Milieux de culture et réactifs.

METHODES

Seuls les tests physico-chimiques (mesure de la température à la réception, du pH, de l’acidité titrable, de la densité et test à l’alcool) et enzymatiques (test de la catalase et test au bleu de méthylène) sont effectués sur le lait cru.
Sur les laits caillés sont effectués la mesure du pH et de l’acidité Dornic et des analyses microbiologiques.

Tests physico-chimiques et enzymatiques

La température

Elle est mesurée à l’aide d’un thermomètre de modèle 2212TM qui mesure à la fois la température et l’hygrométrie.
Après avoir nettoyé le bout métallique de la sonde, la mesure de la température se fait par immersion de cette dernière dans le lait. La valeur de la température s’affiche immédiatement sur l’écran de l’appareil.

Le pH

Sur le terrain, c’est un papier pH qui est utilisé. Un bout de papier pH d’environ 1,5cm est immergé à moitié dans le lait, puis retiré de celui-ci. La lecture du pH se fait en comparant la couleur que prend le papier pH qui a été immergé, avec les couleurs qui sont sur la boîte contenant le papier pH. Chaque couleur sur la boîte correspond à une valeur de pH.
Au laboratoire, le pH est mesuré à l’aide d’un pH mètre de marque « HANNA instruments » (8).
Avant d’entreprendre les mesures, l’électrode du pH mètre est nettoyée avec de l’eau de robinet, puis rincée à l’eau distillée et séchée avec du papier buvard.
L’opération débute par l’étalonnage de l’appareil à l’aide de deux solutions de pH connus (4,00 et 7,00). Ensuite, le pH mètre est mis en marche et la mesure se fait par immersion du bout de l’électrode dans le lait. La valeur du pH s’affiche immédiatement sur l’écran. Avant d’entreprendre une autre mesure, l’électrode est à nouveau nettoyée, puis rincée comme précédemment (8).

L’acidité Dornic

Un volume de 10ml de lait est mis dans un bécher, additionné de 2 à 3 gouttes de phénolphtaléine à 1% (dans de l’alcool 95%). Le bécher est ensuite secoué de façon à homogénéiser le mélange. La lessive de soude contenue dans une burette suspendue à une potence, est ajoutée au mélange jusqu’à son virage au rose. La coloration doit persister au moins 10 secondes. La lecture de la chute de la burette est faite. Le résultat peut être exprimé en degré Dornic (°D) ou en gramme d’acide lactique par litre de lait (8).

La densité

Elle est mesurée à l’aide d’un lactodensimètre.
L’éprouvette est remplie de lait et le lactodensimètre y est plongé. La lecture de la densité s’effectue sur la partie graduée émergente du lactodensimètre après stabilisation de ce dernier.
Le facteur de correction pour des températures est de : C = ± 0,0002 degré. Ainsi, lorsque la température du lait est supérieure à 20°C, on corrige en ajoutant autant de fois, le nombre 0,0002 qu’il y a eu de degré de plus.
Par contre, lorsque la température est inférieure à 20°C, il faut faire une correction soustractive (7).

Le test à l’alcool

Il permet de déterminer l’aptitude du lait à la pasteurisation (5).
Dans un tube à essais ou une boîte de Pétri sont mélangés en quantité égale (2ml) du lait et de l’alcool éthylique à 68°. La réaction est immédiate.
Le résultat est positif s’il y a présence de floculation : le lait est instable à la chaleur. Il est négatif s’il y a absence de floculation : le lait est stable (11).

Le test de la catalase

Dans une boîte de Pétri, sont déposées quelles gouttes de lait et une goutte de H2O2.
Le test est positif s’il y a un dégagement abondant de bulles d’air (O2). Il est négatif dans le cas contraire.

Le test au bleu de méthylène

Il consiste à verser dans un tube à essais contenant 1ml de bleu de méthylène à 5%, 10ml de lait. Le tube de couleur bleue est placé à l’étuve à 37°C.
L’évolution de la couleur du tube est suivie tous les quarts d’heures, jusqu’à la disparition de la teinte bleue. La durée nécessaire à la décoloration du lait dans le tube est notée (11).

Analyses microbiologiques

Protocole d’analyses

Les techniques utilisées sont des méthodes classiques et font référence aux normes françaises (AFNOR) et internationales (ISO).

Préparation de l’échantillon

Tous les échantillons étudiés ont subi un traitement préliminaire permettant d’obtenir les dilutions selon la norme NF V08-010 (Mars 96) (1).
Dans un sachet « STOMACHERND », sont introduits 10ml de l’échantillon auxquels sont ajoutés 90ml d’eau peptonée tamponnée (EPT). 20 autres millilitres de l’échantillon sont prélevés pour les analyses physico-chimiques (pH et acidité Dornic, respectivement 10ml pour chaque type d’analyse).
Le contenu du sachet « stomacher » est ensuite homogénéisé et laissé au repos, pendant une vingtaine de minutes, pour assurer la revivification des microorganismes. La solution ainsi obtenue, constitue la suspension mère (10-1).
– 1ml de cette suspension mère est prélevé et ajouté à 9ml d’EPT contenus dans un tube à essais, ce qui donne la dilution 10-2 ;
– 1ml de la dilution 10-2 est ajouté à 9ml d’EPT contenus dans un autre tube à essais, pour réaliser la dilution 10-3 ;
– ainsi de suite, on réalise les dilutions 10-4, 10-5, 10-6, etc.

Recherche et dénombrement des germes

Recherche et dénombrement de la flore lactique

Seuls les lactobacilles ont été dénombrés selon la norme NF ISO 15214.
Le milieu de culture utilisé est la gélose de MAN ROGOSA et SHARPE (MRS).
La gélose MRS fondue et refroidie, est coulée dans des boîtes de Pétri vides, à raison de 15ml par boîte. Après solidification, la gélose est ensemencée en surface avec 0,1ml des dilutions allant de 10-3 à 10-5. L’étalement se fait à l’aide d’un étaleur stérile en verre. Du fait de leur relative sensibilité à l’oxygène, une deuxième couche de gélose MRS est coulée pour diminuer la tension d’oxygène.
Les boîtes sont incubées à 30°C pendant 24 à 48 heures. Les colonies de lactobacilles, rondes ou lenticulaires et de taille variable sont directement comptées.

Recherche et dénombrement de la flore de contamination

Recherche des coliformes thermotolérants

Elle a fait référence à la norme NF-V08-060 (Mars 96) (1). Le milieu utilisé est la gélose VRBL (gélose lactosée biliée au cristal violet et au rouge neutre).
1ml de dilutions 10-1 à 10-6 sont respectivement ensemencés dans six boîtes de Pétri vides au cours des premiers jours. Pour les jours suivants, on s’est limité à la dilution 10-3. Environ 15ml de VRBL sont en suite coulés dans chaque boîte, puis homogénéisés par des mouvements circulaires légers. Après solidification de cette première couche, une deuxième plus fine est ajoutée.
Le dénombrement des coliformes fécaux se fait directement après incubation à 44°C pendant 24 à 48 heures. Ne sont prises en compte que les colonies rouges, d’au moins 0,5mm de diamètre.

Recherche et dénombrement de la flore fongique 

Levures et moisissures

Le dénombrement de la flore fongique est réalisé sur gélose glucosée à l’oxytétracycline (OGA), conformément à la norme XP-V08-059 (Oct.96) (1).
La gélose OGA préalablement fondue et refroidie, est introduite dans des boîtes de Pétri vides. De l’oxytétracycline lui est ajouté et l’ensemble est homogénéisé.
Après solidification, ces boîtes sont ensemencées avec 0,1ml des dilutions10-1 à 10-3 en surface, puis incubées à la température du laboratoire pendant 3 à5 jours.
L’observation quotidienne des boîtes est nécessaire pour déceler à temps les éventuelles colonies envahissantes.

La lecture permet d’apprécier 

– les levures dont l’aspect rappelle celui des colonies bactériennes. Elles peuvent avoir des bords réguliers ou irréguliers, des formes convexes ou plates et sont pigmentées, souvent opaques ;
– les moisissures toujours pigmentées, d’aspect velouté, plus ou moins proéminent.

Expression des résultats

La formule pour l’expression des résultats est la suivante :
ΣC N = V (n1 + 0,1n2) d
N : Nombre de germes /g
ΣC : Somme des colonies comptées sur toutes les boîtes retenues de deux dilutions successives
V : Volume de l’inoculum appliqué à chaque boîte (en ml)
n1 : Nombre de boîtes retenues à la première dilution
n2 : Nombre de boîtes retenues à la deuxième dilution
d : Taux de dilution de la première boîte retenue.

CRITERES MICROBIOLOGIQUES DE REFERENCE DES LAITS CAIILES

L’établissement des critères microbiologiques répond à un souci de prévention et de protection de la santé du consommateur et de garantir au produit une meilleure compétitivité sur le marché.