L'ajout du Bevacizumab au doublet standard est associé à un meilleur pronostic

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Invasion cellulaire en Matrigel

A 24h post-transfection, les cellules sont réensemencées dans des inserts équipés d’une membrane poreuse recouverte de Matrigel®, dont la composition est considérée comme analogue à celle de la lame basale sous-jacente à l’épithélium, avec du milieu RPMI sans additif (10mM L-Glutamine et 10% de SVF) supplémenté en mitomycine C (3µl/ml). Les inserts sont placés dans des puits de culture (plaque 24 puits) contenant du milieu RPMI avec additifs et HGF (40 ng/µl) supplémenté en mitomycine C. Après 48h d’incubation, le milieu contenu dans l’insert est aspiré et l’excès de Matrigel® est éliminé à l’aide d’un coton-tige (cf Figure 57, section Résultats partie I.B). Les cellules ayant digérées la matrice et migrées à travers la membrane poreuse sont colorées au crystal violet. Une fois rincée, la membrane poreuse est découpée à l’aide d’un scalpel et montée avec du glycérol entre lame et lamelle, les cellules sont alors comptées au microscope inversé à contraste de phase (leica DM IL LED).

Croissance cellulaire sans adhésion

Culture 3D Nunclon Sphera BD

A 24h post-transfection, les cellules sont réensemencées avec du milieu complet, dans des plaques 24 puits sans adhésion, du milieu frais est ajouté tous les 2 jours. La capacité des différentes lignées à former des sphères selon les traitements est appréciée en photographiant les cellules au 6éme jour du test au grossissement x10 sous un microscope inversé à contraste de phase. Le diamètre des sphères est également mesuré (cf Figure 57, section Résultats partie I.B)

Croissance en agar (Millipore®)

A 24h post-transfection, les cellules sont réensemencées dans 0,4% d’agarose et RPMI complet (4 puits/conditions), au-dessus d’une couche de 0,8% d’agarose et de RPMI complet. Du milieu complet est ajouté tous les 2 jours. Afin de suivre la cinétique d’apparition des colonies selon les traitements et les lignées, des photos sont prises au grossissement x10 au moment de l’ensemencement puis tous les 2 jours jusqu’à 21 jours. Au terme du test, le nombre de colonies et leurs diamètres sont évalués (cf Figure 57, section Résultats partie I.B).

Matériels et Méthodes

Evaluation de l’activité des MMP2/9 par zymographie

Le zymogramme est réalisé par migration électrophorétique d’un aliquot des milieux de culture prélevés au cours du test de cicatrisation dans un gel SDS-Polyacrymamide 7% contenant de la gélatine (1 mg/ml ; le substrat des métalloprotéases). Les dépôts contiennent 15 µL d’échantillon et 15 µL de tampon de charge (Biorad), (10µl + 10µl pour témoin MPP2 et MMP9, enzymes recombinantes commerciales (R&D)). L’électrophorèse en condition dénaturante, s’effectue dans un tampon de migration 1X (25 mM Tris-base, 192 mM glycine et 0,1% SDS, pH 6.8), pendant environ 2h avec deux gels d’acrylamides: un gel de séparation de 7% (20 mA) et un gel de concentration 4.5% (30 mA) permettant aux échantillons de rentrer dans le gel de séparation en même temps en les concentrant. Après la migration, le gel est plongé 2 fois pendant 10 min dans une solution de Triton X100 à 2,5%, sous agitation afin d’éliminer le SDS. Trois rinçages rapides à l’eau distillée puis deux de 20 min sont réalisés afin d’éliminer le Triton X100. Le gel est ensuite incubé une nuit à 37°C dans le tampon de réaction (50 mM Tris-base, 5 mM CaCl2, 2H20 et 2µM ZnCl2, pH8). La révélation se fait par coloration du gel pendant 1 à 2 h dans une solution de coloration (0,1% bleu de Coomassie + décolorant (25% d’éthanol – 10% d’acide acétique)) suivie d’une décoloration progressive avec le décolorant seul jusqu’à apparition de bandes claires.

Statistiques

Analyse des prélèvements tumoraux des patients inclus dans l’essai MAPS : Une première étape est d’abord mise en œuvre, pour éliminer les marqueurs les moins pertinents. Dans ce but, des modèles de Cox n’ajustant pas sur les facteurs de confusion ont été utilisés pour tester l’interaction entre chaque marqueur et le bras de traitement. Seuls les marqueurs pour lesquels le degré de signification de ce test d’interaction est inférieur à 0,20 ont été conservés pour la suite de l’analyse. Un modèle de Cox multivarié descendant a ensuite été appliqué sur les variables âge, PS, sexe, type histologique, TNM IMIG, exposition professionnelle à l’amiante, leucocytose, thrombocytose afin de déterminer des facteurs pronostiques de la survie sur l’ensemble des 2 groupes de traitement. Les variables significatives à p<0,20 dans ce modèle ont été considérées comme des facteurs de confusion potentiels.
Pour chaque marqueur sélectionné, un modèle de Cox multivarié prenant en compte le marqueur, le bras de traitement, l’interaction marqueur × traitement, les cofacteurs identifiés à l’étape 2, a été mis en œuvre. L’influence du marqueur a été évaluée en testant le terme d’interaction de ce modèle.
La prise en compte d’éventuelles interactions non linéaires a été assurée par une approche basée sur les polynômes fractionnels (Royston et Sauerbrei, 2004). La procédure séquentielle de Bonferroni-Holm a été utilisée pour corriger les degrés de signification des tests d’interaction des marqueurs sélectionnés afin de limiter à 5% le risque α global sur cette 3ème étape. A partir des modèles obtenus, les taux de survie et risques relatifs de décès ajustés ont pu être calculés en fonction des niveaux du marqueur et du bras d’étude.
Analyses statistiques des études in cell : l’analyse des différences observées entre les différentes conditions dans les tests cellulaires est réalisée à l’aide d’une analyse de la variance (ANOVA) suivi d’un test post-hoc de Dunnet, test permettant de comparer toutes les conditions testées à un seul contrôle (condition siNeg). Les différences sont considérées comme significatives dès p<0,05.

Ethique

L’étude Bio-MAPS (PHRC national 2007) a fait l’objet d’un avis favorable du CPP (Comité de protéction des personnes) du CHU de Caen en 2007, avec un formulaire spécifique de consentement pour la partie « biomarqueurs » de l’essai (promoteur CHU de Caen pour la phase 2, IFCT pour la phase 3 ; PI coordonnateur : Pr.G. Zalcman) (Annexe).

Table des matières

Liste des abréviations
Liste des Figures
Liste des Tableaux
Introduction
I. Le Mésothéliome Pleural Malin (MPM)
I.A. Le mésothélium pleural : description
I.A.1. La plèvre
I.A.2. Les cellules mésothéliales pleurales
I.B. Les pathologies de la plèvre
I.C. Etiologie et facteurs de risques du Mésothéliome pleural malin (MPM)
I.C.1. Fibres d’amiante et exposition.
I.C.2. Autres facteurs de risques
I.D. Epidémiologie
I.D.1. Les chiffres dans le Monde
I.D.2. Incidence en France
I.D.3. Mortalité en France
I.E. Classification histopathologique du MPM
I.F. Caractéristiques moléculaires de la cancérogenèse pleurale
I.F.1. Dommages induits par les fibres d’amiante
I.F.2. Les altérations génétiques récurrentes du MPM
I.F.2.a. L’inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs
I.F.2.b. L’activation mutationnelle d’oncogènes dans les mésothéliomes n’a pas décrite à ce jour:
I.F.2.c. Le CD44 et l’acide hyaluronique favorisent la signalisation oncogénique
des mésothéliomes
I.G. Prise en charge diagnostique et thérapeutique du mésothéliome pleural malin
II. L’essai clinique de phase III Mesothelioma Avastin Cisplatin Pemetrexed Study
(MAPS)
II.A. Le Protocole MAPS
Le Bevacizumab®, agent anti-II.A.1. angiogénique: nouveau traitement du MPM
association au doublet standard
II.A.2. L’ajout du Bevacizumab au doublet standard est associé à un meilleur
pronostic
II.B. Le Protocole Bio-MAPS
III. La voie de signalisation Hippo
III.A. Description générale
III.B. Présentation détaillée des différents membres de la voie de signalisation
Hippo…
III.B.1. Les régulateurs :
III.B.1.a. RASSF1A, protéine clé de l’homéostasie cellulaire :
III.B.1.b. Autres régulateurs de la voie Hippo :..
III.B.2. Le coeur de la voie Hippo : MST1/2 et LATS1/2 et leurs adaptateurs
III.B.2.a. Les kinases MST et leur protéine adaptatrice WW45
 Régulation de la mort cellulaire
o MST1 et apoptose
o MST1 et Autophagie
 Régulation de la prolifération cellulaire et de la migration
III.B.2.b. Les kinases NDR et leur protéine Adaptatrice
III.B.3. Les effecteurs terminaux : YAP et TAZ
III.B.3.a. Description générale
III.B.3.b. Les régulations de l’activité et la localisation subcellulaire
YAP/TAZ..
III.B.3.c. L’interactome de YAP/TAZ
III.B.3.d. Les gènes cibles de YAP et TAZ
III.C. Implication de l’altération de la voie Hippo dans l’histoire naturelle du MPM.
IV. Objectifs de la thèse :
Matériels et Méthodes
I. Etude Bio-MAPS: Analyse des statuts de méthylation des promoteurs des gènes
RASSF/Hippo chez les patients atteints de MPM inclus dans la phase III de l’essai
MAPS…
I.A. Extraction des ADNs (Kit QIAGEN FFPE®)
I.B. Conversion au Bisulfite de sodium
I.B.1. Principe (Figure 51)
I.B.2. Méthode (Kit de Conversion de Bisulfite EPITECT, Qiagen®)
I.C. PCR spécifique de méthylation (MS-PCR)
II. Etude Bio-MAPS : Analyse des prélèvements tumoraux des patients inclus
l’essai MAPS
III. Etudes in cell:
III.A. Lignées cellulaires
III.B. Culture cellulaire
III.C. Extraction des ARNs (Acides ribonucléiques) totaux
III.D. Transcription inverse et Réaction de polymérisation en Chaine (RT-PCR)
III.D.1. Transcription inverse (RT)
III.D.2. Réaction de polymérisation en Chaine (PCR) en temps réel
III.D.3. Réaction de polymérisation en Chaine (PCR) semi-quantitative
III.E. Détection protéique…
III.E.1. …par Immunofluorescence (IF)
III.E.2. …Western Blot (WB)
III.F. Test de Mort Cellulaire Programmée
III.F.1. Mesure de l’activité Caspase 3/7
III.F.2. Test de Fragmentation d’ADN (kit Cell Death Detection ELISA Roche®
III.G. Incorporation de BrdU (Millipore®)
III.H. Invasion cellulaire en Matrigel®
III.I. Croissance cellulaire sans adhésion
III.I.1. Culture 3D Nunclon Sphera BD®
Croissance III.I.2. en agar (Millipore®)
III.J. Evaluation de l’activité des MMP2/9 par zymographie
IV. Statistiques
V. Ethique
Résultats..
I. La voie RASSF/Hippo est fréquemment perturbée dans le mésothéliome
malin : l’inactivation de MST1 prédit un moins bon pronostic chez les patients atteints
MPM car elle favorise l’invasion, la croissance sans adhésion, la prolifération
diminution de l’apoptose des cellules mésothéliales tumorales
I.A. L’hyperméthylation du promoteur du gène MST1 prédit une moins bonne
des patients atteints de MPM et inclus dans l’essai MAPS
I.B. Identification et caractérisation de modèles cellulaires d’étude du MPM
I.B.1. Les cellules des lignées H2052, H28, H2452 et MSTO-221H présentent
altérations récurrentes du MPM
I.B.2. Fonctionnalité de la voie Hippo dans les cellules de lignées mésothéliales
YAP n’est pas inactivé par la confluence des cellules de la lignée H2052
I.B.3. Le niveau d’expression de YAP est associé à un phénotype invasif
capacité des cellules des lignées de MPM à croître sans adhésion
I.C. L’inactivation de MST1 favorise l’invasion, la croissance sans adhésion,
prolifération et une diminution de l’apoptose des cellules mésothéliales tumorales
I.C.1. Mises au point des extinctions/réexpressions
I.C.2. L’inactivation de MST1 prédit un moins bon pronostic chez les
atteints de MPM car entraine l’invasion, la croissance sans adhésion, la prolifération
une diminution de l’apoptose des cellules mésothéliales tumorales
I.D. Résultats complémentaires
II. L’inactivation de RASSF1A contribue à « l’agressivité » des cellules de
mésothéliales tumorales car elle favorise la translocation nucléaire de YAP et l’expression
d’amphiréguline
II.A.1. Mises au point des extinctions/réexpressions
II.A.2. La présence de RASSF1A diminue la capacité des cellules de lignées
MPM à envahir le Matrigel® et l’expression du CD44 standard.
La perte d’expression de RASSF1A modifie II.A.3. l’activité des effecteurs
terminaux YAP/TAZ des cellules de lignées MSTO-211H et H2452
II.A.4. La perte d’expression de RASSF1A favorise la dissémination des cellules
la lignée MSTO-211H en culture 3D ou en agar..
III. Impact de l’expression du CD44 et l’amphiréguline chez les patients atteints
MPM et inclus dans l’essai MAPS
III.A. Le CD44 standard est un outil diagnostique du MPM
III.B. L’expression de l’Amphiréguline prédit une meilleure survie globale
sans progression des patients atteints de MPM
Discussion Générale
Conclusions et Perspectives
Bibliographie
Annexe : CPP – Essai de phase II/III MAPS