L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE DU MELANGE DES
EXTRAITS DE FEUILLES DE VITEX DONIANA ET DE COMBRETUM MICRANTHUM (G. DON)

RAPPEL SUR LE STRESS OXYDANT 

 Les radicaux libres 

Un radical libre est une espèce chimique (atome ou molécule) contenant un électron non apparié. Ce déséquilibre n’est que transitoire et est comblé par l’acceptation d’un autre électron ou par le transfert de cet électron libre sur une autre molécule [1]. L’appellation espèces oxygénées réactives (ERO) inclut les radicaux libres de l’oxygène mais aussi certains dérivés réactifs non radicalaires avec une toxicité importante [24]. L’Oxydation met en jeu la molécule d’oxygène dont la production par des voies métaboliques non contrôlées engendre la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) tels que les radicaux libres superoxydes O2 •-, hydroxyl HO. , alkoxyl RO• et peroxyl RO2 [40]. Les ERO peuvent être produites par des agents physiques comme les rayonnements, des réactions chimiques et surtout enzymatiques. Cependant la mitochondrie, la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique sont les principaux siéges de libération endogène d’ERO [5]. De façon exogène, elles sont surtout d’origine physique et chimique (ex. radiations X ou gamma, ou UV (315-400 nm) 

 Pathologies liées aux Espèces Réactives à l’Oxygène 

Le stress oxydant correspond à un déséquilibre entre la génération des ERO et leur élimination par les systèmes de défense antioxydante de l’organisme [29]. De nombreuses études ont indiqué que le stress oxydant est potentiellement impliqué dans le développement de plusieurs pathologies humaines telles que l’athérosclérose, le cancer, le diabète, les maladies inflammatoires et cardiovasculaires. Le rôle du stress oxydant a été également évoqué dans les processus de vieillissement des cellules. La plupart des maladies induites par le stress oxydant apparaissent avec l’âge et le vieillissement. Ce phénomène affaiblit les systèmes de défense antioxydante, augmente la production mitochondriale de radicaux et diminue l’efficacité des systèmes de réparation et de dégradation des espèces oxydées [44]. La figure 1 présente les différents radicaux libres et les ERO impliques en biologie. 6 Figure 1 : Origine des différents radicaux libres et espèces réactives de l’oxygène impliqués en biologie [

Prise en charge des radicaux libres dans l’organisme

 L’homme est un être aérobie, sa survie dans un environnement riche en oxygène dépend de l’équilibre vital entre la production physiologique des radicaux libres et la capacité de l’organisme à les éliminer. Ainsi, l’organisme dispose de différents systèmes de protection contre les radicaux libres parmi lesquels nous pouvons citer : les systèmes de protection endogènes (enzymatiques et non enzymatiques) et les systèmes de protection exogènes .

Systèmes enzymatiques de lutte contre les radicaux libres

 Ils comprennent les superoxydes dismutases (SOD), la catalase et le glutathion peroxydase :  Les superoxydes dismutases Les superoxydes dismutases (SOD) é1iminent les radicaux superoxydes par dismutation du radical en H2O2 • et en HO+• et HO• mais provoquent l’apparition de peroxyde d’hydrogène diffusible et dangereux à distance. La synthèse des SOD subit un rétrocontrô1e négatif par les 7 fortes concentrations de peroxyde d’hydrogène. L’activité des SOD est dépendante des apports nutritionnels en cuivre et à un moindre degré en zinc [20].  La catalase Le peroxyde d’hydrogène, produit par la réaction de dismutation, peut subir une réaction de Fenton. Il ne faut pas donc qu’il s’accumule, c’est le rôle de la catalase qui transforme le peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène qui sont des composés stables [29].  La glutathion peroxydase La glutathion peroxydase (GPx) est une enzyme qui constitue l’un des plus importants systèmes enzymatiques de protection car elle est capable non seulement de détoxifier le peroxyde d’hydrogène, mais aussi d’autres hydro-peroxydes résultant de l’oxydation du cholestérol ou des acides gras. La GPx se trouve dans le cytoplasme et dans les mitochondries ; elle nécessite la présence de deux cofacteurs importants : le glutathion réduit et le sélénium [8]. La figure suivante résume les différents sites d’actions des systèmes enzymatiques de prise en charge des ERO. Figure 2 : Mode d’action des principaux systèmes enzymatiques antioxydants et de leurs cofacteurs métalliques 

Système non enzymatique de lutte contre les radicaux libres

 Parmi les antioxydants exogènes, nous pouvons citer les vitamines A, B6, C et E ; les polyphénols, la β-carotène, le zinc, ainsi que le sélénium [3].  La vitamine E (ou α-tocophérol) L’α-tocophérol est le principal antioxydant contenu dans les lipoprotéines de basse densité (LDL). La vitamine E interrompt la chaîne de propagation radicalaire dans les membranes en limitant la peroxydation des acides gras polyinsaturés (AGPI). En effet, la cinétique de cette étape de propagation étant lente, la vitamine E peut l’arrêter, en réparant le radical peroxyl (AGPIOO·) par la formation d’hydroperoxyde (AGPI-OOH). Dans cette réaction de piégeage, la vitamine E devient à son tour radicalaire et la vitamine C la régénère [8].  La vitamine C (ou acide ascorbique) La vitamine C agit principalement en piégeant directement les ERO (majoritairement les espèces O2 ·- et l’ONOO- ). Elle est aussi capable de recycler l’α-tocophérol de façon à agir en synergie avec ce dernier dans la prévention de la peroxydation lipidique : T-OH + AGPI-OO· → T-O·+ AGPI-OOH Asc-H + T-O· → T-OH + Asc·  Les composés phénoliques Les polyphénols sont considérés comme des composés quasi-universels des végétaux. Structurellement, ils se répartissent en plusieurs classes allant de composés présentant un simple noyau phénolique (acide gallique) à des composés polymériques complexes comme les tanins. Les polyphénols constituent les principes actifs de nombreuses plantes médicinales. On les trouve, d’une manière générale, dans toutes les plantes vasculaires, où ils peuvent être localisés dans divers organes : racines, tiges, feuilles, fleurs et fruits [32]. Il existe de nombreux composés phénoliques dont certains sont présentés ci-après.  Les flavonoïdes Ce sont les composés polyphénoliques les plus abondants contenus dans les végétaux. Leur structure comprend un squelette composé de deux cycles aromatiques (A et B) porteurs de plusieurs fonctions phénol et réunis par une chaîne de trois atomes de carbone, ces derniers étant le plus souvent engagés dans un hétérocycle avec un atome d’oxygène .  Les tanins Les tanins sont des substances polyphénoliques de structure variée, de saveur astringente, ayant en commun la propriété de tanner la peau, cette aptitude est liée à leur propriété de se combiner aux protéines [29]. De nombreux tanins présentent des propriétés antioxydantes par le piégeage des radicaux libres ou encore par l’inactivation des ions prooxydants. Grâce à leurs fonctions phénoliques, qui ont un fort caractère nucléophile, les tanins sont d’excellents piégeurs de radicaux libres. Ainsi, des activités antimutagènes et anticancéreuses ont été attribuées à certains tanins en raison de leur propriété antioxydante [10].  Les coumarines La présence de plusieurs fonctions phénol confère à ces composés des propriétés antioxydantes ou oxydantes, suivant la position des phénols et le milieu où la réaction prend place. Leur abondance dans divers aliments et boissons, dont la consommation est réputée avoir des effets protecteurs contre différentes affections chroniques, notamment l’athérosclérose et les maladies neurodégénératives, conduit légitimement à s’interroger sur la contribution des flavonoïdes alimentaires à ces effets protecteurs avérés ou supposés [45]. I.4. Mécanisme d’action des antioxydants Il existe deux types d’antioxydants :  Les antioxydants primaires ou radicalaires ou vrais, qui permettent l’interruption de la chaîne auto-catalytique : AH + R·→ A· + RH. La molécule AH est antioxydante si le radical formé A· est plus stable. La stabilité de ce dernier radical peut s’expliquer par sa conversion en composés non radicalaires : A· + A’ → A-A ou A · + R· → A-R.  Les antioxydants secondaires ou préventifs qui assurent l’inhibition de la production des radicaux libres. Ce sont des substances décomposant les hydroperoxydes en alcool, les thiols ou les disulfures. Il s’agit des protecteurs vis-à-vis des rayons UV, comme les carotènes, les chélatants des métaux promoteurs d’oxydation type fer et cuivre, comme l’acide citrique et les lécithines, ou enfin de séquestrant d’oxygène comme l’acide ascorbique

LES METHODES D’EVALUATION IN VITRO DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE 

Il existe différentes méthodes pour mesurer l’activité antioxydante d’une substance in vitro : La méthode à l’ABTS (2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonique)) ; la méthode au DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) ; la méthode ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) ; La méthode FRAP (Ferric Reducing Antioxydant Power) 

 La méthode à l’ABTS

 Lors de la mise en œuvre de ce test, l’ABTS incolore est préalablement oxydé avec du persulfate de potassium (K2S2O8) pour former le radical cationique ABTS+• de coloration bleu-vert (figure 4). L’addition d’un composé antioxydant engendre la réduction du radical ABTS+• en ABTS. L’activité antioxydante est matérialisée par la décoloration de la solution et s’exprime par le pourcentage d’inhibition (PI) de l’absorbance à 734 nm, longueur d’onde à laquelle le radical ABTS+• présente une bande d’absorption maximale caractéristique [40]. La figure 3 montre le passage de la forme réduite de l’ABTS à la forme oxydée. Figure 3: Formation du radical cation ABTS+• à partir de l’ABTS

 La méthode au DPPH 

Le test DPPH repose sur la théorie qu’un donneur d’hydrogène est un antioxydant. Le radical DPPH•, de coloration violette et qui présente une bande d’absorption caractéristique à 517 nm, accepte l’hydrogène qui est cédé par l’antioxydant pour former le DPPH (figure 4). L’effet de l’antioxydant est proportionnel à la disparition du radical DPPH• et à la décoloration de la 11 solution du violet au jaune. L’activité antioxydante s’exprime par le PI de l’absorbance à 517 nm [40]. La figure 4 montre le passage de la forme réduite de l’ABTS à la forme oxydée.