ISOLEMENT ET CARACTERISATION DES CYCLOPEPTIDES DU LATEX DE Jatropha

Ce travail s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche et d’études de cyclopeptides d’origine végétale visant à mettre en évidence des peptides cycliques de structure originale et d’en évaluer des propriétés biologiques, comme antibiotique, antiparasitaire, cytotoxique et immunomodulateur. Il a porté sur le latex de Jatropha integerrima Euphorbiaceae Le latex (50 ml) a été collecté au niveau du jardin des plantes de l’Hôtel Méridien- Président et du jardin botanique de la Faculté des Sciences et Techniques, par incision au niveau des feuilles et des tiges en novembre 2004. Il se présente sous forme de liquide blanchâtre, un peu visqueux. Il est immédiatement conservé à froid à 8° C.

EXTRACTION ET ISOLEMENT DES CYCLOPEPTIDES

Le latex de Jatropha integerrima est repris par 200 ml d’eau distillée. Le mélange eau + latex est introduit dans une ampoule à décanter contenant 250 ml d’acétate d’éthyle. Après agitation énergique, la phase organique (acétate d’éthyle) contenant les cyclopeptides est récupérée et évaporée à sec. Cette opération est répétée trois fois et a donné un extrait organique brut.

SYSTEMES CHROMATOGRAPHIQUES

La phase organique est évaporée à sec et est analysée par chromatographie sur couche mince (CCM). Les peptides sont repérés durant les différentes étapes de l’isolement et de purification par CCM sur gel de silice Merk 60F254 (0,2 mm, support aluminium) avec comme solvant de migration un mélange CH2Cl2/MeOH (90/10 ou 85/15). La détection des peptides cycliques se fait par la coloration au chlore/ortho-tolidine. Cette méthode de coloration permet de révéler les composés peptidiques par la formation d’une coloration bleue. Ce réactif est sélectif des substances contenant le groupement amide -NH-CO- qui donne une couleur bleue après conversion en chloramide. Il est utilisé pour révéler les cyclopeptides qui sont dépourvus des extrémités N-terminales libres. Cette technique de coloration se déroule en deux étapes. La plaque est placée pendant 15 mn dans un milieu contenant du chlore formé in situ par la réaction de l’acide chlorhydrique (HCl) concentré sur des cristaux de permanganate de potassium (KMnO4).

CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE D’EXCLUSION STERIQUE

La fraction brute de masse m=280 mg est dissoute dans 3 ml de méthanol. L’ensemble est soumis à une chromatographie sur colonne d’exclusion stérique sur gel de Séphadex LH20 (Pharmacia Biotech, limite d’exclusion pour M > 1000 Da). L’élution est réalisée avec du méthanol. Les cyclopeptides sont des molécules de grande taille (600-1000 Da) et sont en général récupérés dans les fractions de tête. Cette étape permet d’éliminer une grande partie des molécules de petite taille et de réduire le nombre de chromatographie sur gel de silice. On procède parallèlement à une CCM pour identifier les fractions contenant les cyclopeptides par l’apparition de spots bleus sur le chromatogramme. Il est judicieux à ce moment de faire une étude par RMN pour confirmer la présence de cyclopeptides dans ces fractions par l’observation des protons amides sur le spectre RMN. Les différentes fractions de tête contenant les cyclopeptides sont regroupées puis évaporées à sec. L’extrait peptidique obtenu est pesé m =140 mg.

Les conditions d’élution ont été déterminées au préalable sur CCM puis transposées pour la chromatographie sur colonne. La colonne est éluée avec un système de gradient de solvant CH2Cl2/MeOH. Il sera nécessaire de procéder à plusieurs chromatographies sur colonne gel de silice à cause de nombreuses autres substances qui sont extraites par l’acétate d’éthyle. Les fractions donnant des spots bleus, bien individualisés par CCM, avec o-tolidine comme système de révélation sont ensuite utilisées pour la CLHP. Une masse de 80 mg a été obtenue après chromatographie sur colonne gel de silice.

La fraction peptidique obtenue après chromatographie sur gel de silice SiO2 (m=80mg) est soumise à différentes étapes de chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse (surface non polaire et une phase mobile polaire) sur un appareil Merck équipé d’une pompe L-6200, d’un injecteur automatique AS-2000 muni d’une boucle d’injection de 100 µl et d’un détecteur UV-L4000 réglé à 220 mm et connecté à un enregistreur GILSON NI. Les solvants utilisés sont préalablement dégazés par filtration sur une membrane nylon de 0,45µm. Les séparations sont réalisées sur colonne semi-préparative (débit 2 ml/min) de type Kromasil C18 (5 µm, longueur 250 nm, diamètre 7,8 mm, AIT France).