Ischémie-reperfusion myocardique 

Les expériences ont été réalisées sur un total de 190 rats mâles de souche Wistar âgés de 16 semaines. Le bon état de santé des animaux était garanti à chaque livraison par un certificat sanitaire. Les expérimentations se sont déroulées de septembre 2007 à Mai 2010 au sein des locaux de l’EA:4278 (Avignon, dirigé par le Pr Philippe Obert) ainsi qu’au sein des locaux de l’U637 pour la partie cellulaire au sein (Montpellier, dirigé par le Dr Sylvain Richard) et des locaux de l’UMR5525, TIMC-IMAG équipe PRETA/Cœur & Nutrition, pour certains dosages biochimiques (Grenoble, dirigé par le Pr Joël de Leiris). Les animaux ont été placés dans des conditions standards de température et d’humidité et éclairés selon un rythme 12 heures de jour/12 heures de nuit. L’accès à l’eau et à la nourriture était libre. Ce travail est organisé et présenté selon 3 études distinctes. Pour les études 1 et 2, les rats ont été aléatoirement répartis en début de protocole dans les 2 groupes suivants : – Rats Ctrl : rats placés en environnement standard d’animalerie (Air filtré standard) – Rats CO : rats placés 12 heures par jour en environnement pollué au CO (30-100 ppm) et 12 heures en environnement standard d’animalerie, pendant 4 semaines. Pour l’étude 3, afin d’évaluer les effets potentiellement protecteurs d’un entraînement conduit dans les semaines précédant l’exposition à un environnement pollué, les rats ont été répartis aléatoirement dans les 3 groupes suivants : – Rats Ctrl-Sed : rats placés en environnement standard d’animalerie – Rats CO-Sed : rats placés 12 heures par jour en environnement pollué au CO (30-100 ppm) et 12 heures en environnement standard d’animalerie, pendant 4 semaines.

Exposition au CO

 L’OMS a estimé des seuils d’exposition au CO au-delà desquels la santé de l’individu est mise en cause. Des expositions à 9 ppm pendant 8 heures constituent une limite recommandée à ne pas dépasser. Cependant il existe des périodes de la journée, où ces concentrations sont largement supérieures en milieu urbain. En effet, différentes enquêtes portant sur la qualité de l’air rapportent des concentrations allant de 2 à 40 ppm mais pouvant atteindre 170 ppm en cas de trafic important (Wright et al., 1975 ; Stern et al., 1988 ; Bevan et al., 1991 ; Finkelstein et al., 2005). Ainsi, de manière à simuler une exposition de type citadine au CO, les animaux ont été placés 12 heures par jour dans un caisson hermétique relié à une bouteille de CO. La concentration en CO au sein du caisson était contrôlée en continu à l’aide d’un analyseur de CO de type CHEMGARD Infrared Gas Monitor NEMA 4 Version, (MSA) et régulé grâce à un système d’électrovanne dont l’ouverture et la fermeture étaient contrôlées par informatique. Les rats ont été exposés à une concentration résiduelle de 30 ppm complétée par 5 pics de 1 heure à 100 ppm. Ils étaient ensuite placés 12 heures en environnement standard d’animalerie (air filtré standard d’animalerie, AFS) (Figure 21). Matériel et méthode – 77 – Exposition au CO Air sain 1 jour 0 PPM 30 PPM 1 heure 100 PPM Figure 21 : Pattern type d’exposition au CO (24 heures). Afin d’éviter tout effet aigu du CO au cours des expérimentations, les rats étaient placés, à la fin des 4 semaines d’exposition, 24 heures en environnement AFS avant d’être utilisés pour les expériences. En effet, des travaux préliminaires ont montré que les concentrations d’HbCO, supérieures chez les rats CO par rapport aux rats Ctrl 1 heure et 3 heures après la dernière exposition, ne différent pas entre les 2 groupes 24 heures après la sortie du caisson d’exposition (Figure 22). Matériel et méthode – 78 – +1h +3h +24h 0 1 2 3 4 5 6 7 Controle CO % HbCO Temps post exposition au CO * * Figure 22 : Evolution des taux d’HbCO sanguine suite au protocole d’exposition au CO, * p<0,05 ; rats CO vs. Ctrl. 

Entraînement en endurance 

Selon les recommandations de l’OMS, l’activité physique régulière, définit comme la pratique d’une activité d’une durée minimum de 30 min à intensité modérée au moins 5 jours par semaine (OMS et FIMS, 1995) est bénéfique pour la santé. Partant de ces recommandations, un protocole d’entrainement en endurance à intensité modérée a été mis en œuvre. Ce protocole a été conduit en environnement AFS durant les 4 semaines précédant la période d’exposition au CO à raison de 5 séances consécutives par semaine et les exercices ont été réalisés sur tapis roulant motorisé (Image 1). Durant la première semaine, les animaux étaient familiarisés au tapis roulant avec une première séance de 15 min à une vitesse de 17 m/min. Chaque jour, une augmentation du temps de course de 5 min était réalisée afin d’atteindre 40 min de course en fin de semaine. Les semaines suivantes, chaque séance durait 40 min de course à une vitesse de 17 m/min, puis 18 m/min la troisième semaine, et 20 m/min la dernière semaine. Durant toute la durée du protocole, chaque séance débutait par un échauffement de 5 min à 10 m/min, avec une augmentation progressive de la vitesse jusqu’à atteindre celle requise pour l’entraînement. L’intensité d’effort était estimée tout au long du protocole à environ 50 % de la vitesse maximale aérobie (VMA) des animaux. A l’issu du programme d’entraînement, les rats CO-Ex maintenaient, lors des 4 semaines d’exposition au CO, un entraînement en condition AFS identique à celui réalisé lors de la dernière semaine du protocole d’entraînement, mais à raison de 2 séances par semaine uniquement (Figure 23). Matériel et méthode – 80 – Image 1 : Entraînement de rats sur tapis roulant Séance d’entraînement Entraînés (5j/sem) Sédentaires Monoxyde de Carbone (30/100 ppm) Monoxyde de Carbone (30/100 ppm) Air filtré standard Phénotype Phénotype Phénotype IR IR IR Pré-entraînement Exposition S1 S2 S3 S4 S1 S2 S3 S4 S1 S2 S3 S4 S1 S2 S3 S4 S1 S2 S3 S4 Figure 23 : Organisation du protocole d’entraînement et d’exposition au CO. 

Ischémie-reperfusion myocardique 

Afin d’évaluer spécifiquement les effets d’une exposition chronique au CO sur le myocarde et ainsi de limiter l’influence des différents facteurs circulants possiblement modifiés par une exposition à ce polluant, le protocole d’IR a été réalisé sur un modèle de cœur isolé perfusé de Langendorff (Image 2). Après une injection d’héparine (3000 UI/kg, i.p.), les rats étaient anesthésiés avec du pentobarbital sodique (50 mg/kg, i.p.). Une thoracotomie était réalisée, le cœur rapidement prélevé était immergé dans une solution de Krebs-Henseleit à 4°C afin de stopper toute activité contractile. L’aorte était canulée et le cœur perfusé de façon rétrograde, à pression constante (80 mmHg). Le dispositif de perfusion était constitué d’un réservoir de liquide relié à un piège à bulle et d’une enceinte thermostatée pour maintenir le liquide de perfusion à 37°C (Image 2). Le liquide de perfusion était une solution de Krebs-Henseleit composée de : NaCl 118.3, NaHCO3 25, KCl 4.7, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, Glucose 11.1, CaCl 2.5 ; mM. Cette solution était tamponnée à pH 7.4 et équilibrée par un mélange gazeux composé de 95 % d’O2 et 5 % de CO2. La mesure du débit coronaire, tout au long du protocole, permettait d’évaluer la qualité du montage du cœur sur le système, et ainsi de s’assurer de la viabilité de l’organe tout au long du protocole. Matériel et méthode – 82 – Image 2 : Système de cœur isolé perfusé de Langendorff. 

Fonction cardiaque et mort cellulaire au cours de l’IR

 Les atriums gauche et droit étaient excisés et le nœud sinusal délicatement écrasé de manière à stopper la contraction autonome du cœur. Un ballonnet en latex, relié à un capteur de pression, était introduit dans le VG via les valves mitrales afin de mesurer la pression développée par ce dernier. Une fois le ballonnet introduit, le cœur était stimulé électriquement à une fréquence de 300 battements par minute. Le volume du ballonnet était ensuite ajusté afin que celui-ci adhère aux parois de la cavité, puis réglé afin d’obtenir et de maintenir une pression diastolique de 5 mmHg tout au long de la période de stabilisation. Afin de réaliser l’ischémie, un fil de suture (fil de soie 6-0) était placé autour de l’artère coronaire antérieure gauche (ACG). Au bout de 30 min de stabilisation, l’occlusion était réalisée en nouant le fil Matériel et méthode – 83 – de suture sur un tube en plastique placé à la surface du cœur, formant ainsi un point de compression sur l’artère. L’ischémie myocardique régionale était maintenue 30 min, puis le tube en plastique était retiré, permettant ainsi la reperfusion de la zone ischémiée. La reperfusion était maintenue pendant 2 heures. A partir des tracés de pression, la pression développée (Pdev ; mmHg ; définie comme la différence entre la pression systolique et diastolique), ainsi que les dérivées maximales (+dP/dtmax ; mmHg/s) et minimales (-dP/dtmax ; mmHg/s) de pression ont été calculées tout au long du protocole d’IR (Figure 24). La mesure du débit coronaire (ml/min) était réalisée par recueil et quantification des effluents coronaires tout au long du protocole de cœur isolé. La perfusion tissulaire était calculée à l’aide du rapport entre le poids du cœur et le débit coronaire (perfusion myocardique en ml/min/mg). Matériel et méthode – 84 – 10 min P. Systolique 0.2 sec P. Diastolique Pression (mmHg) Stab. Ischémie Reperfusion Ligature coronaire P. Développée Figure 24 : Paramètres de pression au cours du protocole d’IR sur cœur isolé perfusé Après 2 heures de reperfusion, le fil de suture était renoué de manière à obtenir une occlusion totale de la zone à risque (zone ischémiée). Une solution de Bleu d’Evans (5 ml, 2 %) était alors injectée progressivement afin de distinguer la zone perfusée (colorée en bleue) de la zone non perfusée ou zone à risque (non colorée) (Figure 25). Le cœur était ensuite congelé, puis ultérieurement découpé en 5 fines tranches (perpendiculairement à l’axe baseapex), incubées chacune pendant 25 min à 37°C dans une solution de triphenyl-tetrazolium chloride (TTC, 0.5 mg/ml). L’incubation dans le TTC permet de faire apparaître, en présence d’enzymes déshydrogénases, une coloration rouge brique du myocarde sain. Au contraire, dans les zones infarcies, caractérisées notamment par une absence d’activité enzymatique, aucune coloration n’est observée (blanc/brun) (Figure 25). Après coloration au TTC, les coupes de cœur étaient maintenues pendant 72 heures dans du Formol, puis analysées par Matériel et méthode – 85 – planimétrie (logiciel ImageJ, V1.28 image processing and analysis software from the National Health Institute, U.S.A.). La zone à risque était exprimée en pourcentage de la surface du cœur, et la zone infarcie était exprimée en pourcentage de la surface de la zone à risque.