Interaction de la porphyrine avec des LDL

En suivant les changements de fluorescence de la DP : schéma global de la fixation

Comme nous l’avons déjà évoqué, l’association de la deutéroporphyrine aux LDL conduit à un changement important de son spectre d’émission de fluorescence sous excitation à 395 nm. Nous avons donc, dans un premier temps, suivi l’évolution de ce spectre en ajoutant des quantités croissantes de LDL à une solution de porphyrine (figure 4.8). Les spectres obtenus sont très similaires aux spectres de la DP dans un environnement lipidique [13, 118]. Nous y reviendrons plus longuement, mais remarquons d’ores et déjà que chaque LDL fixe largement plus de 4 porphyrines. En effet, à la plus forte concentration en lipoprotéine utilisée, toute la porphyrine est incorporée alors que le rapport DP/LDL est d’environ 7. La fixation  de la porphyrine aux lipoprotéines fait donc intervenir au moins un second type de fixation, qui n’induit pas de quenching de la fluorescence à 330 nm de l’apoB-100 et implique la partie lipidique des LDL, soit la surface soit le cœur de cholestérol. De ce fait, nous l’avons défini comme fixation de classe L. Néanmoins, lorsque la concentration en LDL est suffisante pour fixer toute la porphyrine, la forme des spectres d’émission et d’excitation ne dépend pas du rapport DP/LDL. Les propriétés de fluorescence de toutes les formes fixées de la porphyrine sont donc similaires, et nous ne les distinguerons donc pas.
La solution de porphyrine utilisée est à une concentration suffisamment faible pour qu’aucun effet d’écran ne se produise. A une longueur d’onde donnée, la fluorescence des solutions correspond donc à la combinaison linéaire de celle de chaque forme de la porphyrine. En ne distinguant que la porphyrine libre (PF), dont le maximum d’émission est à 609 nm, et la porphyrine liée aux LDL (PB), qui fluoresce plus dans le rouge (621 nm), la fluorescence à ces deux longueurs d’onde s’écrit :
Les facteurs fF,609, fF,621, fB,609 et fB,621 ont été déterminés grâce à des expériences de calibrage, d’une part sur des solutions de porphyrine seule à différentes concentrations, et d’autre part de la même façon avec de la porphyrine liée à des LDL (en excès). A partir de ces équations, les concentrations PF et PB ont été déterminées pour toutes les solutions dont les spectres ont été mesurés et dont certains sont donnés en figure 4.8. La quantité de deutéroporphyrine fixée augmente avec la quantité de LDL ajoutée, et atteint un plateau qui correspond à l’incorporation de toute la porphyrine présente dans la solution (figure 4.9).
Sur l’ensemble des expériences réalisées selon le même protocole, la valeur de KLDL déduite à partir de nos données expérimentales est de (5,8±1,2)×108 M-1.
L’intersection entre le niveau de plateau et la pente initiale de la courbe indique qu’environ 4×10-9 M de LDL peut incorporer autour de 2×10-7 M de deutéroporphyrine, ce qui signifie que chaque particule peut fixer une cinquantaine de molécules de porphyrine. Ce résultat est en bonne adéquation avec d’autres mesures faites dans les mêmes conditions avec d’autres porphyrines [74, 75].
Dans un second temps, nous avons voulu approfondir ces résultats afin de proposer une vue d’ensemble de ces associations. Il nous fallait donc distinguer la fixation de classe P et la fixation de classe L. Nous avons pour cela utilisé la méthode de Scatchard qui permet d’établir des modèles de fixation impliquant plusieurs types de sites. Dans ce cadre, la fixation globale est décrite par :
A partir des spectres d’émission de fluorescence de solutions contenant toujours la même concentration en LDL, et des quantités croissantes de porphyrine, les équations (4.5) nous ont permis de déduire les concentrations PF et PB correspondantes. L’ajout de ces concentrations de plus en plus importantes de porphyrines conduit à la saturation progressive des LDL. La quantité de DP fixée augmente, et atteint un plateau qui correspond à 55 molécules par lipoprotéine, ce qui est en très bon accord avec nos résultats précédents. Les points de Scatchard obtenus à partir de nos données ont été ajustés, par régression non linéaire, par la relation donnée par l’équation (4.9). Nous avons pour cela utilisé le logiciel MathCad. La figure 4.10 montre bien l’aspect bi-phasique des points de Scatchard expérimentauxet de la courbe théorique correspondante. Les valeurs des paramètres de fixation déduites de cette figure sont données dans le tableau 4.1.

L’équilibre de l’interaction LDL-porphyrine

In fine, les changements de fluorescence de la deutéroporphyrine, ainsi que le quenching du tryptophane associé à la fixation de cette molécule aux LDL, nous a permis de caractériser deux types de fixation. Le premier, impliquant quatre sites discrets, est associé au phénomène de quenching de la fluorescence intrinsèque des lipoprotéines. Nous l’avons défini comme fixation de classe P. Le second, par contre, ne met pas en jeu des sites de fixation discrets. Bien qu’un phénomène de saturation du LDL soit observé à partir d’environ 50 molécules de porphyrine fixées, cette association se comprend mieux comme un phénomène de solubilisation, de répartition entre phase aqueuse et phase lipidique.
Les sites de classe P sont forcément situés à proximité des tryptophanes quenchés par la fixation de la deutéroporphyrine, la distance de Förster associée étant de 1,7 nm. Ils peuvent être localisés sur l’apoprotéine B-100 ou, plus probablement, à l’interface entre les parties protéique et lipidique des LDL. Deux observations abondent en ce sens. D’une part, le spectre de fluorescence intrinsèque de ces particules présente un maximum à 330 nm. Cette valeur est typique de la fluorescence d’un résidu tryptophane dans un environnement fortement apolaire [136]. D’autre part, les propriétés de fluorescence de la deutéroporphyrine associée à ces sites de classe P sont similaires à celles de cette porphyrine dans un environnement lipidique, comme des liposomes.
A partir des spectres d’émission de fluorescence de solutions contenant toujours la même concentration en LDL, et des quantités croissantes de porphyrine, les équations (4.5) nous ont permis de déduire les concentrations PF et PB correspondantes. L’ajout de ces concentrations de plus en plus importantes de porphyrines conduit à la saturation progressive des LDL. La quantité de DP fixée augmente, et atteint un plateau qui correspond à 55 molécules par lipoprotéine, ce qui est en très bon accord avec nos résultats précédents. Les points de Scatchard obtenus à partir de nos données ont été ajustés, par régression non linéaire, par la relation donnée par l’équation (4.9). Nous avons pour cela utilisé le logiciel MathCad. La figure 4.10 montre bien l’aspect bi-phasique des points de Scatchard expérimentauxet de la courbe théorique correspondante. Les valeurs des paramètres de fixation déduites de cette figure sont données dans le tableau 4.1.

L’équilibre de l’interaction LDL-porphyrine

In fine, les changements de fluorescence de la deutéroporphyrine, ainsi que le quenching du tryptophane associé à la fixation de cette molécule aux LDL, nous a permis de caractériser deux types de fixation. Le premier, impliquant quatre sites discrets, est associé au phénomène de quenching de la fluorescence intrinsèque des lipoprotéines. Nous l’avons défini comme fixation de classe P. Le second, par contre, ne met pas en jeu des sites de fixation discrets. Bien qu’un phénomène de saturation du LDL soit observé à partir d’environ 50 molécules de porphyrine fixées, cette association se comprend mieux comme un phénomène de solubilisation, de répartition entre phase aqueuse et phase lipidique.
Les sites de classe P sont forcément situés à proximité des tryptophanes quenchés par la fixation de la deutéroporphyrine, la distance de Förster associée étant de 1,7 nm. Ils peuvent être localisés sur l’apoprotéine B-100 ou, plus probablement, à l’interface entre les parties protéique et lipidique des LDL. Deux observations abondent en ce sens. D’une part, le spectre de fluorescence intrinsèque de ces particules présente un maximum à 330 nm. Cette valeur est typique de la fluorescence d’un résidu tryptophane dans un environnement fortement apolaire [136]. D’autre part, les propriétés de fluorescence de la deutéroporphyrine associée à ces sites de classe P sont similaires à celles de cette porphyrine dans un environnement lipidique, comme des liposomes.
Comme, dans nos expériences, les concentrations de porphyrine et de LDL sont toujours faibles, aucun effet d’écran ne se produit et l’intensité de fluorescence émise par chaque forme de la porphyrine est directement proportionnelle à sa concentration. L’intensité de fluorescence observée est donc la somme de toutes les contributions et sera bi-exponentielle. Des exemples de signaux expérimentaux, correspondant à la solution porphyrique la plus diluée utilisée, sont montrés figure 4.13. Ils présentent toutes les caractéristiques des enregistrements que nous avons obtenus par ailleurs. L’intensité de fluorescence de la porphyrine excitée à 395 nm augmente dans le temps. Les changements du signal de fluorescence sont extrêmement rapides et ces signaux sont très bien ajustés par des courbes monoexponentielles, alors que des signaux bi-exponentiels étaient a priori attendus. Sur des temps plus longs, le signal de fluorescence reste stable. Du moins aucune autre modification que celles décrites ci-dessus n’a été enregistrée lors des expériences au stopped-flow sur des durées allant jusqu’à quelques minutes. De plus, les mêmes mélanges ont été réalisés manuellement de façon à pouvoir mesurer la fluorescence sur des temps plus longs, allant de quelques dizaines de secondes jusqu’à 2 heures, en utilisant un spectrofluorimètre classique. Là encore, aucune modification de fluorescence n’a été mise en évidence. Les signaux sont bel et bien mono-exponentiels.

Justification de l’approximation du pseudo-premier ordre

Comme nous l’avons dit, les signaux donnés figure 4.13 sont similaires à ceux enregistrés lors des expériences réalisées aux autres concentrations mentionnées. Cependant, la qualité de l’ajustement mono-exponentiel, bien que toujours satisfaisante, diminue lorsque le rapport DP/LDL augmente. Cet écart s’explique en partie par le fait que le modèle théorique sur lequel nous nous appuyons est basé sur l’hypothèse que l’interaction de chaque molécule de porphyrine n’est pas modifiée par la présence d’autres molécules déjà associées au LDL. L’association est donc considérée comme étant un processus du pseudopremier ordre. Cette approximation implique que le nombre de sites de fixation est grand devant le nombre de molécules de ligand. Cette condition est remplie aux faibles concentrations en porphyrine ; les sites de classe P sont loin d’être saturés, de même que la phase lipidique qui est en large excès par rapport au nombre de porphyrines incorporées. Par contre, l’approximation n’est plus valable pour les concentrations en porphyrine les plus importantes : Si les lipides restent en net excès par rapport à la porphyrine, l’association aux sites de classe P s’éloigne des conditions où elle peut être simplement décrite comme un phénomène du pseudopremier ordre. L’écart au modèle s’accentue alors pour les faibles concentrations en LDL (figure 4.11). Il faut néanmoins remarquer que, dans la gamme de concentrations utilisée, l’écart reste très peu sensible. L’hypothèse associant les phénomènes observés à un processus de pseudo-premier ordre est valide sur la quasitotalité de la gamme de concentrations que nous avons utilisée.