Identification et caracterisation des virus respiratoires circulant

Les infections respiratoires aiguës (IRA) constituent l’un des principaux facteurs de morbidité et de mortalité infantile dans le monde. Ils représentent une cause majeure de consultation aux urgences. Les IRA ont fait l’objet de nombreuses directives de l’OMS durant la décennie 1980-1990 (http://whqlibdoc.who.int/hq/1990/WHO_ARI_90.7_fre.pdf), mais sont depuis quelque peu oubliées, alors que la pneumonie demeure toujours la première cause de mortalité chez les enfants âgés de moins de 5 ans dans le monde (Bryce et al. 2005).

Dans les pays développés, les IRA représentent 20% des consultations, 75% des prescriptions d’antibiotiques et 30% des absentéismes (WHO 1998). Le taux de mortalité infantile est de l’ordre de 2 à 4% (Emmelin et al. 2007). La pneumonie seule présente 0,05 épisodes par enfant par an correspondant à 4 millions de nouveaux cas chaque année (Rudan et al. 2008). Dans ces pays, certains problèmes liés aux IRA sont plus ou moins résolus: la vaccination a réduit l’incidence de certaines maladies à tropisme respiratoire telles que la grippe, la rougeole, la coqueluche et la diphtérie.

Les problèmes liés aux IRA se situent surtout dans les pays en développement et concernent essentiellement les enfants âgés de moins de 5 ans. Ces derniers présentent 4 à 8 épisodes d’IRA haute ou basse par an (http://www.who.int/whr/1996/en/whr96_fr.pdf). En effet, les IRA représentent 30 à 50% des consultations médicales pédiatriques, 20 à 40% des hospitalisations (Cashat-Cruz et al. 2005) et 20% des décès (Emmelin et al. 2007). L’incidence de la pneumonie seule est estimée à 0,29 épisodes par enfant par an correspondant à 151 millions de nouveaux cas chaque année. En Asie et en Afrique subsaharienne, le nombre annuel de décès est estimé à 2 millions (Rudan et al. 2008). Nombreux sont les facteurs favorisant la forte prévalence des IRA dans les pays en développement. Un des facteurs principaux est la pyramide des âges puisque la population jeune représente près de 50% de la population totale. Interviennent également les facteurs socio-économiques (pauvreté, faible niveau d’éducation des parents), les facteurs environnementaux (pollution, tabagisme, utilisation de bois de chauffe) et les facteurs climatiques.

LES VIRUS RESPIRATOIRES 

Si de nombreuses pandémies dues aux IRA sont documentées depuis 412 avant Jésus Christ (http://archive.thedailystar.net/newDesign/news-details.php?nid=21702), ce n’est qu’au 20ème siècle que les virus responsables d’IRA sont découverts. Le premier virus respiratoire humain identifié est le virus influenza type A (Orthomyxoviridae), décrit en 1933 par l’équipe de Shope (Noble 1982). De 1950 à 1960, d’autres virus responsables d’IRA sont isolés : des Adenoviridae (adénovirus), des Picornaviridae (rhinovirus), des Coronaviridae (coronavirus 229E et coronavirus OC43), des Paramyxoviridae (virus para-influenza et virus respiratoire syncytial). Depuis, d’autres virus ont rejoint le panel des agents responsables des IRA : des Paramyxoviridae (métapneumovirus), des Coronaviridae (SRAS coronavirus, coronavirus NL63 et coronavirus HKU1), et des Parvoviridae (bocavirus).

Les virus respiratoires sont à l’origine de 80% des IRA dont la majorité est due à des virus à ARN (Leruez-Ville 2006). La clinique des infections peut aller des syndromes pseudogrippaux à des infections sévères. Certains virus circulent chez l’homme de façon sporadique tandis que d’autres sont épidémiques. On peut citer:
– les virus respiratoires « classiques » : virus influenza, virus para-influenza, virus respiratoire syncytial, adénovirus, rhinovirus, coronavirus (OC43 et 229E) ;
– les virus non respiratoires « classiques » responsables de pneumopathies : virus de la rougeole, virus de la varicelle, cytomégalovirus, virus herpès simplex-1 ;
– les nouveaux virus respiratoires :
o virus respiratoires émergents : coronavirus SRAS (coronavirus associé au syndrome respiratoire aiguë sévère), coronavirus MERS (coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient), henipavirus, hantavirus ;
o virus récemment identifiés : métapneumovirus, bocavirus, coronavirus (HKU1 et NL63), polyomavirus, parechovirus, anellovirus, mimivirus.

A ce jour, une proportion des cas de pneumonies chez l’adulte et des cas de bronchiolites et pneumonies chez les enfants reste toujours sans agents étiologiques associés. Cependant, depuis quelques années, ce nombre tend à diminuer du fait de la découverte de nouveaux virus respiratoires et du développement de nouvelles techniques de diagnostic.

Les virus à ARN

Les virus influenza

Historique
Le terme « grippe » ou « influenza » est créé pour la première fois en 1703. Il vient de l’italien «Influenza di freddo» qui signifie « sous l’influence du froid » : à cette époque, les gens attribuaient la maladie à une influence astrale défavorable. Le virus de la grippe humaine est isolé pour la première fois en 1933 par Smith et al. (Chang et al. 2009). Il est le premier agent découvert comme responsable des IRA.

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Caractéristiques des virus influenza
Les virus influenza appartiennent à la famille des Orthomyxoviridae . Ces virus sont caractérisés par leur affinité pour les mucoprotéines d’où leur nom scientifique «Myxovirus influenzae » (myxo=mucus). Il existe 3 types de virus influenza : le virus influenza de type A (FLUA) isolé en 1933, le virus influenza de type B (FLUB) isolé en 1940 et le virus influenza de type C (FLUC) isolé en 1950 (Hilleman 2002). Plusieurs points peuvent différencier ces trois types notamment au niveau des propriétés antigéniques de leur nucléocapside et de leur matrice. De plus, les glycoprotéines de surface des FLUA sont hautement variables, permettant à ces virus d’évoluer au fil du temps. Alors que les FLUB et C infectent de préférence l’homme, provoquant habituellement des infections bénignes, les FLUA ont un large spectre, allant de l’homme à d’autres mammifères tels que le porc, le chien, le chat, le furet, le singe, le phoque, la baleine, le cheval. Certains des oiseaux domestiques peuvent également être infectés par ces virus tandis que les oiseaux sauvages (aquatiques) jouent le rôle de réservoir naturel.

Les virus grippaux sont des virus enveloppés, à ARN simple brin segmenté et de polarité négative. Ils sont généralement sphériques avec un diamètre allant de 80 à 120 nm mais certains peuvent avoir des formes filamenteuses avec un diamètre jusqu’à 300 nm .

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE: REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE I: LES VIRUS RESPIRATOIRES
1.1 Les virus à ARN
1.1.1 Les virus influenza
1.1.2 Les virus respiratoires syncytiaux
1.1.3 Les métapneumovirus humains
1.1.4 Les virus para-influenza
1.1.5 Les rhinovirus
1.1.6 Les coronavirus
1.2. Les virus à ADN
1.2.1 Les adénovirus
1.2.2. Les bocavirus
CHAPITRE II: PATHOGENESE ASSOCIEE AUX INFECTIONS RESPIRATOIRES VIRALES
2.1. Le système respiratoire
2.2 Physiopathologie
2.3 Mécanismes généraux de défense
2.3.1 Les défenses mécaniques et micro-écologiques
2.3.2 L’immunité innée
2.3.3 L’immunité adaptative
CHAPITRE III: LES METHODES DE DIAGNOSTIC
3.1 La culture cellulaire
3.2 La détection microscopique
3.3 Les tests de détection antigénique
3.4 La sérologie
3.5 La microscopie électronique
3.6 Les méthodes moléculaires
DEUXIEME PARTIE: PRESENTATION DES TRAVAUX
CHAPITRE I: DEVELOPPEMENT D’OUTILS DE DIAGNOSTIC DES VIRUS RESPIRATOIRES
1.1 PRESENTATION DE L’ETUDE
1.2 MATERIELS ET METHODES
1.2.1 Techniques de biologie moléculaire
1.2.2 Choix des régions génomiques cibles
1.2.3 Choix des amorces et sondes
1.2.4 Choix des fluorophores
1.2.5 Amplifications génomiques
1.2.6 Test de spécificité
1.2.7 Test de sensibilité
1.2.8 Test de reproductibilité
1.2.9 Evaluation de la technique
1.3 RESULTATS
1.3.1 Les fluorophores choisis
1.3.2 Test de spécificité
1.3.3 Test de sensibilité
1.3.4 Test de reproductibilité
1.3.5 Evaluation de la technique
1.4 DISCUSSION
CHAPITRE II : ETUDE DE L’ETIOLOGIE DES SYNDROMES PSEUDO-GRIPPAUX A ANTANANARIVO
2.1 PRESENTATION DE L’ETUDE
2.2 MATERIELS ET METHODES
2.2.1 Sujets d’étude
2.2.2 Prélèvements biologiques
2.2.3 Extraction des acides nucléiques
2.2.4 Analyse des échantillons
2.2.5 Sous-typage des virus grippaux A
2.2.6 Analyse des données
2.3 RESULTATS
2.3.1 Caractères démographiques et cliniques des patients inclus
2.3.2 Détection virale
2.3.3 Circulation virale
2.4 DISCUSSION
CHAPITRE III : ETUDE DE L’ETIOLOGIE DES SYNDROMES DE DETRESSE RESPIRATOIRE AIGUË A ANTANANARIVO
3.1 PRESENTATION DE L’ETUDE
3.2 MATERIELS ET METHODES
3.2.1 Sujets d’étude
3.2.2 Prélèvements biologiques
3.2.3 Extraction des acides nucléiques
3.2.4 Analyse des échantillons
3.2.5 Sous-typage des virus grippaux A
3.2.6 Analyse des données
3.3 RESULTATS
3.3.1 Caractères démographiques et cliniques des patients inclus
3.3.2 Détection virale
3.3.3 Corrélation entre coïnfections et sévérité
3.3.4 Circulation virale
3.4 DISCUSSION
CHAPITRE IV: ETUDE DE L’EPIDEMIOLOGIE MOLECULAIRE DES VIRUS RESPIRATOIRES
4.1 PRESENTATION DE L’ETUDE
4.2 MATERIELS ET METHODES
4.2.1 Echantillons cliniques
4.2.2 Isolement cellulaire
4.2.3 Choix des régions génomiques étudiées
4.2.4 Amplification génique
4.2.5 Séquençage des produits PCR
4.2.6 Analyse par blast
4.2.7 Recherche de mutation
4.2.8 Analyse phylogénétique
4.3 RESULTATS
4.3.1 Epidémiologie moléculaire des virus respiratoires syncytiaux
4.3.2 Epidémiologie moléculaire des métapneumovirus humains
4.3.3 Epidémiologie moléculaire des rhinovirus
4.3.4 Epidémiologie moléculaire des coronavirus OC43
4.3.5 Epidémiologie moléculaire des adénovirus
4.4 DISCUSSION
CHAPITRE V : ETUDE SUR LES VIRUS RESPIRATOIRES CHEZ LES ANIMAUX : DETECTION DE CORONAVIRUS CHEZ LES CHAUVES-SOURIS ENDEMIQUES DE MADAGASCAR
5.1 PRESENTATION DE L’ETUDE
5.2 MATERIELS ET METHODES
5.2.1 Sites d’étude
5.2.2 Capture et échantillonnage
5.2.3 Extraction d’ARN et transcription reverse
5.2.4 Amplification génique
5.2.5 Séquençage et analyse phylogénétique
5.3 RESULTATS
5.3.1 Détection virale
5.3.2 Analyse des séquences et étude phylogénétique
5.4 DISCUSSION
CONCLUSION

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