Identification des pathogènes par le Vitek MS

Identification des pathogènes par le Vitek MS

L’identification des microorganismes se faisait à partir de colonies isolées sur les différents milieux gélosés. Nous avons préféré travailler sur des colonies jeunes, au moins sur des cultures de 24 heures.

Mode opératoire

La calibration se fait à l’aide d’une souche d’Escherichia coli ATCC 8739. Cette souche est stockée au congélateur à une température de -80°C. Les explications et détails sont décrits en Annexe 2. Le MALDI TOF peut fonctionner selon deux modes :  Le mode IVD (in vitro diagnosis) : calibré pour la routine et exigeant une bonne identification de la souche de référence pour identifier les germes à tester. C’est une base de données non modifiable qui contient les spectres d’environ 800 espèces bactériennes et fongiques.  Le mode RUO avec une base de données prolongée (SARAMISTM [v4.09] : destiné à la recherche et n’exigeant pas l’identification de souche calibrant pour donner des résultats (FALL et al., 2015). 

Préparation des échantillons

La spectrométrie de masse (Vitek MS de Biomerieux) que dispose, l’Hôpital Principal de Dakar, fonctionne avec des plaques métalliques (réutilisables ou jetables) et présentent 48 puits de dépôt. Ainsi il a besoin de trois ordinateurs relié à un réseau que sont les suivant : 14  La Prep-Station : la préparation des échantillons se fait à partir de la Prep Station (Figure 7) .C’est un module constitué d’un ordinateur et d’un scanner optique servant à introduire les différentes données des échantillons (NLAB, bactérie, levure) et leur emplacement sur la lame.  Le deuxième ordinateur est lié à l’appareil, et il sert à piloter le MALDI-TOF.  Le troisième ordinateur est la base de données des spectres connus qui sert à faire la correspondance avec le spectre obtenu à partir du MALDI-TOF. Figure 7 : La Prep Station

Traitement des échantillons 

À l’aide d’une anse calibrée de 1 µl, prélever une colonie à tester et la déposer sur les puits cibles.  Tester l’échantillon en double.  Sur les 2 dépôts, ajouter 1µl de matrice CHCA qui va permettre l’ionisation de l’échantillon.  Pour les levures, déposer l’échantillon et traiter avec 0.5 µl d’acide formique.  Laisser sécher, puis ajouter 1µl de matrice.  Pour la calibration, faire un dépôt avec la souche Escherichia coli 8739 dans le puits prévu à cet effet, puis déposer 1µl de matrice.  Indiquer les emplacements de chaque échantillon sur la lame en spécifiant s’il s’agit de bactéries ou de levures car les spectres d’acquisition sont séparés dans deux bases de données différentes.  Une fois la lame (Figure 8) terminée, transférer les données de la Prep Station vers le Vitek MS, placer la lame sur le porte-lame , l’introduire dans le Vitek MS et lancer l’analyse.  L’automate réalise le vide dans la chambre d’analyse et il est alors possible de lancer la séquence d’identification.  La Figure 9 montre les étapes de la préparation de l’échantillon.

Lecture et interprétation des résultats

Le calibreur est lu avant et après chaque série et le résultat doit être bon pour valider les résultats des échantillons soumis au système. Ainsi le logiciel MYLA® compare le spectre obtenu avec sa base de données et calcule un score de corrélation sur la réalisation de cent profil dont trente profils constituent le minimum acceptable pour réaliser la comparaison. Une fois l’analyse terminée le MS affiche les résultats dans le Lunch Pad sous forme de spots et indique le pourcentage d’identification. A la fin les résultats sont classés par famille, genre et espèce par le SARAMIS BASE Premium et le tout est récupéré sur des tableaux d’Excel afin de déterminer le pourcentage d’identification pour les différents germes. Les résultats font intervenir deux paramètres : le degré de confiance ou score en pourcentage (Figure 10) et le niveau de confiance affiché par des icônes de formes et de couleurs différentes (Figure 11).