Génotypage et de recherche de résistances aux antiviraux pour le cytomégalovirus humain
STRUCTURE DU VIRUS ET DU GENOME
Le virion mature est une particule enveloppée mesurant de 150 à 200 nm de diamètre. Il est constitué de différents éléments : • L’enveloppe • Le tégument • La capside • Le génome Figure 2 : Structure du CMV (7) 1. L’enveloppe L’enveloppe du CMV est constituée d’une bicouche lipidique dérivée des membranes de la cellule hôte infectée. Elle exprime à sa surface plusieurs glycoprotéines (gp) transmembranaires, dont les plus étudiées sont les glycoprotéines B (gB), H (gH), L (gL), M/N (gM/N) et O (gO), codées respectivement par les gènes UL55, UL75, UL115, UL100, UL73 et UL74. Le constituant le plus abondant de l’enveloppe est la protéine gB, impliquée dans l’attachement du virus à la membrane de la cellule hôte et son entrée dans celle-ci. Associée en dimère, elle compose le complexe protéique gCI. Elle est présente sur toutes les membranes des cellules infectées et est incorporée dans le virion lors du processus d’enveloppement. C’est aussi la protéine la plus conservée entre les CMV des différentes espèces (8)(9). Les glycoprotéines gH, gL et gO composent le complexe protéique gCIII qui facilite le transport vers la surface cellulaire et l’entrée du virus dans la cellule. Le complexe gCII est composé des glycoprotéines gM et gN.
Le tégumen
t Le tégument, situé entre la bicouche lipidique de l’enveloppe et la capside, est une structure amorphe composée de phosphoprotéines. Les protéines du tégument représentent plus de la moitié des protéines présentes dans les virus infectieux. La plupart présentent un intérêt particulier en raison du rôle qu’elles jouent dans le cycle de réplication du CMV, notamment pp65, pp71, pp150 et pp28 (10). Les protéines pp65, la plus abondante du tégument, est impliquée dans la neutralisation des réponses immunitaires innées et adaptatives pendant les infections par le CMV (notamment par son activité enzymatique kinase). Ainsi, elle empêche les cellules infectées d’être détruites par le système immunitaire. La pp71 joue quant à elle, un rôle important dans l’activation de l’expression génétique au début du cycle de réplication lytique. Les pp150 et pp28 sont très immunogènes et jouent des rôles dans l’assemblage et la sortie des particules virales (11).
La capside
La capside, de forme icosaédrique, fait un diamètre d’environ 100 nm et se compose d’au moins 7 protéines différentes (12) : • La protéine pUL86, ou protéine majeure de capside, MCP («Major Capsid Protein»). Elle participe à la formation des pentamères et hexamères qui sont la base de la structure icosaédrique. • La protéine pUL85, ou protéine mineure de capside, mCP («minor Capsid Protein»). Elle est située à l’intérieur de la capside et permet l’ancrage de l’ADN à la capside. • La protéine pUL46 ou protéine mineure de fixation, mC-BP («minor capsid-Binding Protein») assure l’ancrage de l’ADN génomique. • pUL48/49 ou la petite protéine de capside, SCP (« Smallest Capsid Protein »). Elle est nécessaire à l’assemblage des particules virales infectieuses. • Trois autres protéines dérivant du peptide pUL80.
Le génome
Le génome du CMV est le plus long et le plus complexe de tous les herpès virus humain, avec un ADN linéaire bicaténaire d’une longueur de 230kb (7). La teneur en G+C est de 57%. Il code environ 180 protéines, dont 35 protéines constitutives de la particule virale. Le génome se divise en 2 séquences uniques : une séquence longue unique, UL (Unit Long), correspondant à 85% du génome, et une séquence courte unique, US (Unit Short). La région UL est encadrée par des séquences répétées TRL (Terminal Repeat Long) et IRL (Internal Repeat Long), alors que les séquences TRS (Terminal Repeat Short) et IRS (Internal Repeat Short) entourent la région US (13). Quatre isoformes différentes du génome viral peuvent apparaitre au cours de la réplication virale selon l’orientation des segments UL et US (Figure 3) Figure 3 : Représentation des 4 isomères possibles, notés de 1 à 4. Il existent plus de 200 cadres de lecture ouvert, ou Open Reading Frame (ORF) en anglais, permettant au CMV de coder pour toutes ces protéines (14). Le premier séquençage complet du virus a été publié en 1990 et correspond à la souche de laboratoire AD169 qui est la plus étudiée. Elle compte 230 288 paires de base (15). D. MECANISME DE REPLICATION : LE CYCLE VIRAL Le CMV se réplique uniquement dans les cellules humaines, mais a un tropisme cellulaire très étendu. La durée du cycle viral est variable selon la localisation cellulaire (allant de 48-72h dans les fibroblastes, jusqu’à 7 jours dans les cellules souches neurales). C’est pourquoi, in vitro, les cellules de choix pour l’isolement viral sont les fibroblastes humains embryonnaires. 27 1. Attachement et entrée du virus L’entrée du virus nécessite une adhésion à la surface cellulaire via les heparan-sulfates à l’aide des complexes gM/gN et gB viraux. Elle implique la participation d’un grand nombre de récepteurs cellulaires encore mal connus. Les glycoprotéines gB et gH se lieraient de manière spécifique au récepteur membranaire EGF-R (epithelial growth factor) (16) et de manière aspécifique à l’annexine II ou à la β2 microglobuline. Le virus peut pénétrer par endocytose, comme c’est le cas dans les cellules endothéliales, ou par fusion de la membrane virale et de la membrane cellulaire. Ceci aboutit à la libération de la capside et des protéines du tégument dans le cytoplasme cellulaire. La capside est transportée jusqu’au noyau où l’ADN viral est libéré, circularisé et l’expression des gènes très précoces commence. Figure 4 : Mécanisme d’attachement et pénétration du CMV 2. Cycle productif Le cycle de réplication du CMV se déroule entre 24 et 48h après l’endocytose. La protéine tégumentaire pp71 active l’expression du promoteur majeur très précoce, le MIEP (major immediate early promoteur) et induit l’expression en cascade des gènes viraux en 3 phases successives (17) : 28 • La phase très précoce (ou IE pour Immediate Early) : rapide et correspondant à l’expression de gènes IE important dans l’initiation et la maintenance de l’expression des gènes lors du cycle lytique et latent. • Le phase précoce (ou E pour Early) : correspondant à l’expression des gènes E, qui permettent la production des protéines impliquées dans la réplication de l’ADN viral (notamment la polymérase virale pUL , la protéine accessoire pUL , les sous-unités du complexe hélicase-primase, pUL70, pUL102, pUL105 et la kinase virale pUL97). L ’ADN viral est circularisé et répliqué en une multitude de copies assemblées bout à bout pour former une molécule d’ADN bicaténaire. • La phase tardive (ou L pour Late) : correspondant à l’expression des gènes L, commençant à être exprimés 24h après l’infection et codant pour des protéines de structure du virion. La réplication de l’ADN viral se prolonge durant la phase tardive, puis vient sa maturation, son encapsidation dans les capsides néoformées puis la tégumentation des virions. Une partie des virions matures est ainsi libérée dans le milieu extracellulaire, tandis que l’autre moitié reste attachée à la membrane plasmique. Les nouveaux virions ont une demi-vie de 24 à 48h
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