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Les trois générations des insecticides organiques de synthèse

La première génération des insecticides organiquesde synthèses est antérieure à 1940. Elle comprend les produits les plus anciens qui ont été utilisés contre les insectes. Deux groupes de composés ont été synthétisés à cette époque comme insecticides et acaricides : le dinitro-o-crésylate de potassium et le dinitro-orthocrésol (DNOC) (figure 2). Un second groupe de composés, les alkylthiocyanates, comme l’isobornylthiocyianate, a été développé à partir des années 30 (Thacker, 2002).
PartieA. La chimie des organophosphorés Chapitre I. Aperçu bibliographique sur les organophosphorés
1. Dinitrophénols
2. Insecticides inorganiques (y compris arsénicauxet fluuorés)
3. Fumigants
4. Organochlorés (DDT,HCH,Cyclodiènes)
5. Organophosphorés
6. Carbamates
7. Pyréthrinoïdes
8. Néonicotinoïdes
9. Régulateurs de croissance de l’insecte (RCI)
10. D’origine microbiologique
11. D’origine botanique
12. Autres (Pyrazole, Pyrrole, etc.)
Figure 1. Différentes catégories d’insecticides (exprimées en pourcentage du nombre de molécules répertoriées par Wood, 2004).
La deuxième génération est celle des molécules quisont arrivées sur le marché au moment de la Seconde Guerre mondiale ; les hydrocarbures polyaromatiques comprenant :
• Les organochlorés que nous avant évoqués à traversl’exemple du DDT ;
• Les carbamates, dont les premières molécules insecticides, les dithiocar-bamates, avaient été synthétisées dès 1931 (Fournier, 1988);
PartieA. La chimie des organophosphorés Chapitre I. Aperçu bibliographique sur les organophosphorés
• Les organophosphorés mis au point par les Allemands, pendant les années 40-45, à partir des gaz de combat utilisés au cours de la Première Guerre mondiale.
Dinitro-orthocrésol (DNOC)
En effet, à cette époque, ils étaient « bon marché», efficaces et apparaissaient sans effets secondaires notables. Nous savons maintenant qu’il n’en était rien, sans doute à cause de l’usage massif et inconsidéré qui en a été fait. Mais il utfa garder en mémoire que, dans les années cinquante, ces produits ont représenté le savoir-faire d’une époque qui a permis d’accomplir des progrès considérables au niveau de la santé ainsi ueq de la production alimentaire.
La troisième génération d’insecticides organiques ed synthèse est arrivée sur le marché à partir du dernier quart du vingtième siècle. Certains (Firn, 2003)) classent dans cette catégorie tous les composés apparus à partir des années 70. Ysont alors répertoriés les pythrinoïdes de synthèse commercialisés à partir de 1974, mais aussi les phénylpyrazoles, comme le fipronil découvert en 1987 et commercialisé en 1992, les néonicotinoïdes, comme l’imidachlopride apparu à la même période, ou les benzoylurées commediflubenzuron.

Principales familles d’insecticides organiques de synthèse

Les organochlorés, organophosphorés, carbamates et pyréthrinoïdes représentent la grande majorité des insecticides organiques de synthèse qui ont été employés ou sont utilisés actuellement.

Les organochlorés

Ces insecticides possèdent dans leur structure au moins une liaison carbone-chlore. On distingue trois familles d’insecticides organochlorés : celles du DDT et des HCH (hexachlorocyclohexane) ainsi que les cyclodiènes.

Les carbamates

Le remplacement des organochlorés a été accéléré pal’ pparition et l’utilisation des carbamates qui sont une famille de composés organiques porteur d’une fonction R-HN-(C=O)O-R’. Il s’agit en fait des esters substitués de l’acide carbamique ou d’un amide substitué.
PartieA. La chimie des organophosphorés Chapitre I. Aperçu bibliographique sur les organophosphorés

Les pyréthrinoïdes

S’il y a un insecticide d’origine végétale qui a connu un succès sans précédent, c’est bien le pyrèthre, composé extrait du chrysanthèmeChrysanthemum cinaearefolium. Cependant, ce biopesticide n’a jamais pu être utilisé en agriculture à cause de sa labilité en présence de la lumière solaire. Aussi est-ce très tôt que la chimie de synthèse s’est attachée à mettre au point des composés photostables : les pyréthrinoïdes (Ware, 1991).

Les organophosphorés

Les organophosphorés contiennent un atome de phosphore dans leur structure chimique. Ils sont regroupés en trois grands groupes :
• Les dérivés aliphatiques, avec une chaîne carbonée;
• Les dérivés phénylés qui contiennent un noyau phényl dans leur structure ;
• Les dérivés hétérocycliques dans lesquels le ou cycles incluent des atomes d’oxygène, d’azote ou de soufre.
Au regard de la synthèse bibliographique précédemment établie sur les insecticides organiques de synthèse. Notre choix s’est porté surla synthèse de deux nouveaux composés organophosphorés linéaires de type phosphoramidates, et de déterminer leurs toxicité envers des protistes ciliés d’eau douce particulièrementParamecium sp.

Synthèse des phényl phosphoramidates

Introduction

Dans le but de préparer des composés phosphorylés tels que les phosphoramidates, notre choix s’est porté sur le Phényl dichlorophosphonique (PDCP), qui nous a semblé le plus adapté pour introduire le motif « P=O » en plus de sa grande réactivité.

Propriétés physiques et chimiques

Le Phényl dichlorophosphonique (Tableau 2) est un liquide incolore transparent légèrement volatile, d’odeur piquante et fumante. Stable dans les conditions recommandées de stockage, né dans des conditions normales de traitement. La décomposition par la chaleur peut provoquer le dégagement de gaz et de vapeurs irritantes des oxydants forts.
-Réactivité de Phényl dichlorophosphonique

Avec les amines

La combinaison de l’amine sur le PDCP permet l’accès aux composés de type phosphoramidates (Yangl et al., 1998) (Figure 3).

Avec les amino alcools

Le 1,3,2 oxozaphosphorino [4,3-a] a été synthétisépar la réaction homocalycotomine (1) avec les dérivés appropiés de dichlorophosphore.L’hétérocycle a été obtenu sous forme de deux isomères (1’) et (1’’) (Fulop et al., 2000) (Figure 4).

Avec les aminoesters

Une liaison P-N se forme par substitution nucléophile du chlore par l’aminoester (Mehellou et al., 2007) en milieu triéthylamine(Figure 5).

Avec les diamines

La condensation de diamines avec le Phényl dichlorophosphonique en présence de triméthylamine en excès donne des composés hétérocycliques contenants le motif phosphoryle (Phényl Diazaphospholidine oxydes) (Tyeet al., 2002) (Figure 6).

Synthèse des Phényl phosphoramidates

Au cours de ces dernières années, la synthèse de nouveaux composés spécifiques potentiellement actifs et contenant des fonctions caractéristiques s’est développée et a connu un essor important. L’introduction du groupement phosphoryle (P=O) peut être apportée par plusieurs réactifs, notre choix s’est porté sur lephenyl dichlorophosphonique (PDCP) (Yikang et al., 2000) pour sa disponibilité d’une part et sa réactivité d’autre part.
Les produits précurseurs ; amines primaires présentent un site nucléophile (NH), cette réactivité est mis a profit dans la réaction de phosphorylation. Les Phényl phosphoramidates PA-A et PA-B ont été préparé par réaction d’une amine primaire (cyclohexylamine et benzylamine) avec le phényl dichlrophosphonique en une seul étape dans l’acetonitrile comme solvant à -5°C pendant 12 h. Ces composés phosphorés ont été purifiés sur colonne de gel de silice éluée au CHCl -MeOH (9/1) (Figure 7).

Caractéristiques physico-chimiques

Les phosphoramidates (PA-A et PA-B) se présentent sous forme d’une poudre blanche avec des rendements élevés. Leurs points de fusioncompris entre (154-162°C). Ces composés sont solubles dans différents solvants polaires révélés au bleu de Molybdène et visible en UV (Tableau 3).

Etude structurale

Les structures des composés préparés ont été parfaitement élucidées par les méthodes spectroscopiques usuelles: infrarouge, résonance magnétique nucléaire du proton, du phosphore et C13.
o En RMN 1H : La formation de phosphoramidates est confirmé par l’apparition d’un signal du NH-P=O vers (2.40-3) ppm sous forme d’un singulet, le Phényl porté par le phosphore apparaîtentre 7 et 8 ppm sous forme de multiplet et d’autres signaux correspondant au reste des protons des amines.
o En infrarouge : on remarque une bande d’absorption vers (1107.1- 1253.6) cm-1qui correspond à la liaison (P=O). La bande de groupement (NH) et (C-N-P) apparaissent respectivement vers (3155.3-3209.3) cm-1 et (1118.6- 1029.9) cm-1.

Protocoles expérimentaux de synthèse

Techniques utilisées

La chromatographie

C’est une technique de séparation très puissante qui permet de travailler sur des quantités allant jusqu’au microgramme (g). Les séparations chromatographiques sont baséessur les propriétés physiques des molécules « volatilité, lubilitéso et adsorption ». Les mélanges des substances à séparer sont placés dans des conditions dynamiques dans lesquelles deux de précédentes propriétés peuvent se manifester.

La chromatographie sur colonne

Cette technique de chromatographie solide-liquide est de type préparatif. Elle permet la séparation des quantités de substances qui peuventvarier de 500mg à plusieurs grammes, le tout dépend du diamètre de la colonne et de la quantitéd’adsorbant.
Dans un premier temps, on remplie la colonne de la phase solide absorbante imprégnée d’un solvant, le niveau du liquide dans la colonne est abaissé au sommet de l’adsorbant (on utilise souvent 20-30 g de silice pour 1 g de produit). L’échantillon à fractionner et dissout dans un minimum de solvant (celui qui est déjà utiliser) ; on le dépose au sommet de la colonne pour subir l’élution. Le solvant est ajouté à la colonnepour développer la séparation. L’effluant est récupéré sous forme de plusieurs fractions qui sontanalysées par CCM. Les fractions de l’effluant contenant les mêmes substances sont conditionnées et isolées par évaporation du solvant. Les chromatographies sur colonne de gel de silice ont été effectuées avec de la silice Merck 60 H (Art.9385).

L’extraction

L’extraction est une méthode de purification qui consiste à isoler une substance d’un solide à l’état pur, ou d’une solution par contact avec un solvant qui dissout sélectivement le produit désiré ; la séparation s’effectue dans uneampoule à décanter qui permet la séparation des phases organiques et aqueuses avec un minimum de perte.

La distillation

C’est la principale méthode de séparation et de purification des liquides. Elle consiste à évaporer le liquide par chauffage, condenser les vapeurs obtenues et récupérer le condensas.

Résonance magnétique RMN

Les spectres RMN du proton ont été enregistrés à température ambiante sur un appareil : AC 200 BRUKER, AC 250 BRUKER. Les déplacements chimiques (δ) sont exprimés en ppm par rapport au signal CDCl3 fixé à 7.24 ppm ou DMSO-d6 fixé à 2.49 ppm. La multiplicité des signaux est indiquée par une ou plusieurs lettre(s) minuscule(s) : S (singlets), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet), dd (doublet dédoublé), m(massif) les constantes de couplage J sont exprimées Hertz (Hz).
Les spectres infrarouge (IR) ont été en registrésurs un spectromètre Perkin-Elmer FT-1600. Les points de fusion non corrigés ont été déterminés en capillaire sur un appareil Electrothermal BÜCHI 510.
Les produits ont été relevés par pulvérisation dea ninhydrinel à 5% dans l’alcool éthylique puis chauffage et à la lumière UV (245 nm) pour les composés comportant un ou plusieurs groupement(s) chromophore(s).

Préparation des phényl phosphoramidates

Mode opératoire général

Dans un ballon de 250 ml sous agitation magnétique, est placé dans l’acétonitrile anhydre, 1 équivalent de phényl dichlorophosphonique. A l’aide d’une ampoule à brome surmontée d’une garde à CaCl2, on additionne, goutte à goutte, 4 équivalents d’une amine primaire dans le même solvant à 0°C. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation magnétique pendant 12 heures. L’évolution de la réaction est suivie par CCM, quimontre la formation d’un produit moins polaire, soluble dans les solvants polaires, révélé par pulvérisation au Molybdène par une tache bleue, le produit il est révélé aussi à la nhydrine.

Table des matières

Introduction
Partie A. La chimie des organophosphorés
Chapitre I. Aperçu bibliographique sur les organophosphorés
1- Introduction
2- Evolution des insecticides organiques de synthèse
2-1- Définition et classification
2-1-1- Une réalité complexe
2-1-2- Les trois générations des insecticides organiques de synthèse
3- Principales familles d’insecticides organiques de synthèse
2-1- Les organochlorés
2-2- Les carbamates
2-3- Les pyréthrinoïdes
2-4- Les organophosphorés…
Chapitre II. Synthèse des phényl phosphoramidates
1- Introduction
2- Propriétés physiques et chimiques du PDCP
3- Réactivité de phényl dichlorophosphonique
3-1- Avec les amines
3-2- Avec les amino alcools
3-3- Avec les aminoesters
3-4- Avec les diamines
4- Synthèse des phényl phosphoramidates.
4-1- Caractéristiques physico-chimiques
4-2- Etude structurale
Chapitre III. Protocoles expérimentaux de synthèse
1- Techniques utilisées
1-1- La chromatographie
1-1-1- La chromatographie sur colonne
1-2- L’extraction
1-3- La distillation
1-4- La résonance magnétique RMN
2- Préparation des phényl phosphoramidates
2-1- Mode opératoire général
2-2- Traitement
Partie B. Etude expérimentale
Chapitre I. Etude bibliographique sur les protistes ciliés
1- Rappel sur la biodiversité microbienne
1-1- Rappel sur les protistes.
1-2- Phylogénie des protistes
1-3- Taxinomie
2- Rappels sur la paramécie (Paramecium sp.)
2-1-Mouvement
2-2- Reproduction
2-3- Alimentation
2-4- Respiration
2-5- Génomique et mécanismes d’évolution de la paramécie
3- Justification du choix de Paramecium sp. comme modèle biologique
Chapitre II. Outils d’évaluation en écotoxicologie
1- Les biomarqueurs: notions et concepts
1-1- Définition et rôle(s) biologique(s)
1-2- Qualités requises
2- Pistes de recherche retenues pour l’étude des xénobiotiques de synthèse
2-1- Etude du stress oxydant
2-1-1- Le système antioxydant cellulaire
2-1-2- L’étude du stress oxydant, son intérêt en écotoxicologie…
2-1-3- Biomarqueurs de stress oxydant retenus pour notre étude
2-1-3-1- L’activité catalase
2-1-3-2- L’activité glutathion S transférase
2-1-3-3- Le glutathion, un antioxydant non enzymatique
Chapitre III. Matériels & méthodes
1- Technique d’isolement et d’identification de Paramecium sp
1-1- Technique d’isolement des paramécies
1-2- Décontamination des cellules
1-3- Identification de Paramecium sp
1-4- Culture pure de Paramecium aurelia
2- Préparation des échantillons en vue des analyses biologiques.
2-1- Matériel biologique
2-2- Matériel chimique
3- Protocoles expérimentaux mis en place
3-1- Calcul du nombre de cellules
3-2- Calcul du nombre et du temps de génération…
3-3- Calcul du taux de croissance cellulaire
3-4- Calcul du pourcentage de réponse
3-5- Dosage de la charge protéique
3-5-1- Principe de dosage des protéines totales
3-5-2- Protocole expérimental
3-6- Dosage de la quantité de glutathion total (GSH)…
3-6-1- Principe du dosage
3-6-2- Protocole expérimental
3-7- Dosage de l’activité de la glutathion S-transférase (GST)
3-7-1- Principe du dosage
3-7-2- Protocole expérimental …
3-8- Dosage de l’activité de la catalase (CAT)….
8-1- Principe du dosage.
3-8-2- Protocole expérimental
3-9- Etude du métabolisme respiratoire…
3-9-1- Principe du dosage
3-9-2- Protocole expérimental
3-10-Résonance magnétique
3-11- Détermination de le concentration inhibitrice (CI50)
3-11- Analyse statistique
Chapitre IV. Résultats
1- Cytotoxicité et stress oxydant du PA-A
1-1- Effet du PA-A sur la morphologie et la paroi des paramécies
1-2- Effets sur croissance cellulaire
1-3- Calcul du pourcentage de réponse (P.R.)
1-4 Détermination de la concentration inhibitrice CI50
1-5- Détermination du nombre et du temps de génération cellulaire
1-6- Détermination du taux de croissance des paramécies….
1-7- Variations du taux de protéines totales….
1-8- Taux de glutathion total
1-9- Effet du PA-A sur le métabolisme respiratoire de la paramécie.…
1-10- Etude du stress oxydant…
1-10-1- Effets du PA-A sur l’activité glutathion S-transférase…
1-10-2- Effets du PA-A sur l’activité catalase….
2- Etude de la toxicité du PA-B sur la paramécie
2-1- Effet du PA-B sur la morphologie et la paroi des paramécies
2-2- Effets sur la croissance cellulaire.
2-3- Calcul du pourcentage de réponse.
2-4 Calcul de la concentration inhibitrice CI50
2-5- Détermination du nombre et du temps de génération cellulaire
2-6- Effet du PA-B sur le taux de croissance des paramécies…
2-7- Effet du PA-B sur l’évolution du taux de protéines totales.
2-8- Effet du PA-B sur l’évolution du taux de GSH
2-9- Effet du PA-B sur le métabolisme respiratoire des paramécies
2-10- Etude du stress oxydant…
2-10-1- Effet du PA-B sur l’évolution de l’activité GST
2-10-2- Effet du PA-B sur l’évolution de l’activité CAT
Chapitre V. Discussion
Conclusion & Perspectives
Références Bibliographiques
Résumé
Abstract

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