Généralités sur la culture in vitro

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Généralités sur la culture in vitro

La culture in vitro est une technique visant à régénérer une plante entière à partir d’organes, tissus ou de cellules végétales en conditions contrôlées sur un milieu nutritif. Elle se fait en quatre phases qui sont : l’introduction du matériel végétal, la multiplication, l’enracinement et l’acclimatation (sevrage). De plus, l’usage des techniques de culture in vitro nécessite peu d’espace, un temps réduit et peut-être programmé indépendamment des saisons (Vidalis et al., 1989).

Conditions physiques en culture in vitro

Lumière et photopériode

La lumière, facteur déterminant pour la culture in vitro des plantes, est indispensable au déclenchement et au bon déroulement de certains processus morphogénétiques. Sa qualité dépend de l’intensité de l’éclairement et de la qualité spectrale de la lumière reçue par la culture (Ghomari, 2015). La photopériode influence significativement la prolifération, la croissance et le développement de l’explant (Lepoivre, 2003).

Température

Dans les conditions de culture in vitro, la température est généralement régulée en tenant compte des espèces (tropicales ou tempérées). Pour la patate douce, elle varie entre 24/26°C en continu. Par ailleurs la température dans les flacons de culture peut être supérieure de 2 à 4°C à la température de la pièce à cause de la lumière. Toutefois, selon Lê, (1994), ce sont des faibles températures de 15°à 20°C qui stimulent la micro tubérisation chez la pomme de terre. Tchetche et al. (2008) ont pu montrer que l’incubation des vitroplants à des températures non régulières incite une irrégularité de l’évapotranspiration des plants, et par conséquent une diminution de leur croissance.

Hygrométrie

Elle doit atteindre environ 100% d’humidité relative dans les récipients de culture. Cependant, il est important de ne pas asphyxier les explants par un excès de condensation à la surface du milieu (Thiam, 2017).

Les régulateurs de croissance

Un régulateur de croissance, appelé également « phytohormone », est défini comme étant, une substance qui, suivant sa concentration absolue ou relative dans le milieu, peut supprimer, stimuler ou modifier sous certaines conditions les processus de différenciations (Vidalis et al., 1989). Ils sont classés en cinq groupes : auxines, cytokinines, gibbérellines, acides abscissiques et éthylènes (Margara, 1989).
Les auxines et les cytokinines sont des régulateurs de croissance indispensables au bon démarrage et à l’entretien de cultures de tissus végétaux en conditions in vitro (Skoog et Miller 1957).

Les techniques de culture in vitro

Plusieurs techniques sont utilisées pour la culture des tissus.

Embryogenèse somatique

Cette technique a été décrite pour la première fois chez la carotte en 1958 par Reinard et Stewart cité par Ghomari et al. (2015). A la suite de ces travaux sur des cultures cellulaires de carotte, l’embryogenèse somatique expérimentale a été largement développée chez un grand nombre d’espèces monocotylédones en raison des difficultés à leur micropropagation in vitro (Michaux-Ferriere et al., 1992). Toutefois, cette technique est désormais répandue chez les dicotylédones tant herbacées que ligneuses (Sané, 1998 ; Sané et al., 2006; Sané, 2007).

Culture de méristèmes

Le méristème apical correspond au dôme apical entouré d’une paire ou de deux paires de primordia foliaires. Il est constitué de tissus en expansion continue, conférant une organogenèse permanente chez les végétaux supérieurs (Iftekhar, 2010). Plusieurs travaux ont été réalisés dans le but d’obtenir des plants indemnes de virus par la technique de culture de méristème. En général, ces derniers sont cultivés sur milieu MS additionné de BAP, d’ANA et GA3 (Triqui, 2009). La détection des virus peut se faire soit par indexage en greffant la plante supposée infectée sur des plantes indicatrices sensibles telle que Ipomoea setosa ou par détection sérologique de type ELISA ou Dot-ELISA (Feng et al., 2000).

Micropropagation

La micropropagation apporte un avantage considérable par rapport aux méthodes traditionnelles avec des taux de multiplication de 100 à 1000 fois plus élevés et en un temps plus réduit (Ochette, 2005).
D’un point de vue pratique, les systèmes de production de semences par micropropagation représentent une alternative intéressante et efficace pour constituer rapidement un stock de matériel de qualité sanitaire irréprochable. Ils peuvent aisément être intégrés dans le cadre d’un approvisionnement en plants de haute qualité destinés à la production de semences certifiées (Changins, 2011).

MATERIEL ET METHODES

Matériel végétal

Le matériel végétal utilisé est issu de plants de patate douce provenant de la collection du Centre International de Pomme de terre élevés en serre et de boutures prélevées dans les parcelles de la station de l’ISRA à Sangalkam.
Les tests ont porté sur une variété à chair jaune-blanchâtre Boly et deux autres à chair orange Dina et Beau Regard.

Méthodologie

Désinfection des explants

Des tiges de patate douce saines ont été prélevées sur des plants de 2 mois élevés sous serre. Elles ont été abondamment lavées à l’eau de robinet puis passées à l’alcool 70° pendant une durée de 30 secondes avant d’être rincées trois fois de suite avec de l’eau savonneuse. Les tiges ont ensuite été désinfectées à l’aide d’une solution d’hypochlorite de sodium à 4° chlorométrique sous la hotte à flux laminaire. Différents temps de trempage des tiges ont été testés 10 ; 15 ; 20 ; 25 et 30 minutes en vue de définir le temps qui permet d’enregistrer le taux de reprise des boutures le plus élevé associé à un plus faible taux d’infection des explants. Trois séries de rinçages de 5 mn ont été effectuées avec de l’eau distillée stérile après chaque temps de trempage. Les tiges ainsi désinfectées ont été découpées sous la hotte en boutures uni nodales de 1 à 1,5 cm puis sont placées en culture dans des tubes à essais contenant 15 ml d’une solution de Murashige et Skoog (1962) additionnée de kinétine.
Les taux de décontamination, de débourrement et de nécrose des explants en fonction du temps de trempage dans l’hypochlorite de sodium à 4° chlorimétrique ont été estimés par rapport au nombre d’explants mis en culture (24 tubes par traitement).
Les fragments de tiges destinés à la culture de méristèmes, ont été prélevés à un stade précoce à l’extrémité des tiges des plants élevés en serre. Ils sont moins durs et très fragiles. Ainsi, un temps de trempage de 10 mn a été effectué sur tous les traitements suivis de 3 rinçages d’une durée de 5 mn chacun à l’eau distillée stérile.
Figure 3: Désinfection des explants : a) boutures issues de plants élevés en serre, b) Explants en désinfection à différents temps de trempage

Préparation des milieux de culture

Afin de préparer 1 L de milieu de culture de base MS (Murashige et Skoog 1962) solide, nous avons mélangé 20g de sucre, 100 mg de myo-inositol, 50 ml de solution macroéléments, 1 ml de solution macroéléments, 1 ml de solution de vitamines, 5 ml de solution de Fer EDAT dans une q.s.p 1L d’eau distillée. Les milieux sont solidifiés avec de l’Agar (7 g/l) après ajustement du pH à 5,7. Ils sont ensuite placés dans un four microonde jusqu’à ébullition avant d’être distribués dans les tubes à essais à l’aide d’un distributeur automatique. Pour chaque traitement (culture de méristèmes et micropropagation), 24 répétitions ont été réalisées puis stérilisées à l’autoclave.
Les tests sur la micropropagation ont été réalisés sur le milieu de Murashige et Skoog (1962) solide additionné de différentes concentrations de kinétine : 0 ; 1 : 1,5 ; 2 ; 2,5 ; et 3 mg/l.
La culture de méristèmes a été effectuée sur un milieu de Murashige et Skoog (1962) liquide supplémentés de Kinétine et de GA3. La kinétine a été ajoutée avant la stérilisation du milieu. Par contre, la GA3, thermolabile, a été stérilement ajoutée sous la hotte à flux laminaire à l’aide d’un filtre millipore, une aiguille et d’une micro pipette à cône stérile. Les concentrations en phytohormones additionnées sont présentées dans le tableau 2.
L’état de stérilité des milieux a été vérifié en conservant les tubes remplis pendant 3 jours avant utilisation.

Table des matières

INTRODUCTION
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Présentation de la patate douce
1.1 Origine
1.2 Systématique
13 Types variétaux
1.4 Ecologie
1.5 Culture et rendement
1.6 Ennemis de la culture
1.6.1 Maladies
1.6.2 Ravageurs
1.7 Intérêt et importance économique
1.7.1 Marché et économie
1.7.2 Aspect nutritionnel et diététique
1.7.3 Utilisations
1.8 Système semencier de la patate douce
1.8.1 Différents niveaux de multiplication de matériel de plantation
1.8.2 Règlementation sur les semences de patate douce
2. Généralités sur la culture in vitro
2.1 Conditions physiques en culture in vitro
2.1.1 Lumière et photopériode
2.1.2 Température
2.1.3 Hygrométrie
2.1.4 Les régulateurs de croissance
2.2 Les techniques de culture in vitro
2.2.1 Embryogenèse somatique
2.2.2 Culture de méristèmes
2.2.3 Micropropagation
MATERIEL ET METHODES
1. Matériel végétal
2. Méthodologie
2.1 Désinfection des explants
2.2 Préparation des milieux
2.3 Culture de méristèmes
2.3.1 Substrat et condition de culture
2.3.2 Initiation des méristèmes
2.4 Micropropagation
2.5 Acclimatation en mini serre
2.5.1 Préparation des mini serres
2.5.2 Acclimatation des vitroplants
2.6 Production de boutures en mini serre
2.6.1 Mise en place des traitements
2.6.2 Paramètres étudiés
3. Analyse statistique des données
RESULTATS
1. Désinfection des explants
2. Assainissement par culture de méristèmes
3. Multiplication in vitro en présence de kinétine
3.1 Effet de la kinétine sur le développement caudal et foliaire et racinaire
3.2 Effet de la kinétine sur la croissance et le développement des variétés
4. Acclimatation en mini serre
5. Repiquage en mini serre
5.1 Effet du type de bouture sur le développement des plants
5.2 Effet du type de substrat sur la croissance des plants
5.2.1 Comparaison des paramètres de croissance en fonction du type de substrat
5.2.2 Comparaison des paramètres de croissance en fonction du type de bouture cultivé sur les différents substrats testés
DISCUSSIONS
1. L’hypochlorite de sodium permet de désinfecter des explants de patate douce prélevés sur le terrain
2. L’acide gibbérellique associé à la kinétine stimule la croissance et le développement des méristèmes de patate douce
3. La kinétine optimise les capacités des explants de patate douce à développer des organes en conditions in vitro
3.1 La kinétine favorise l’élongation et la phylogenèse des explants de patate douce
3.2 La kinétine favorise le développement racinaire des explants de patate douce
3.3 La kinétine présente un effet différentiel sur la croissance et le développement chez les différents génotypes de patate douce
4. L’utilisation des mini serres permet d’optimiser l’acclimatation des vitroplants de patate douce
5. Le type de substrat et la taille des boutures influencent la croissance et le développement des plants de patate douce pendant la phase de sevrage
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES