Phase précoce de l’embryogenèse

Les différentes étapes de l’embryogenèse ont été étudiées et caractérisées, chez Arabidopsis, au début des années 90 . L’embryogenèse débute par l’allongement du zygote qui, à la suite d’une division asymétrique, donne naissance à une cellule basale allongée et à une petite cellule apicale. La cellule apicale subit trois mitoses et forme une structure sphérique appelée embryon octant. Le développement de la moitié supérieure de cet embryon produit la partie aérienne de la plantule tandis que la partie inférieure se différencie en hypocotyle et radicule. La cellule basale conduit quant à elle à la formation d’un suspenseur.
Le suspenseur est constitué de cellules alignées, en nombre variable, allant par exemple de 7 cellules chez Arabidopsis à plus de 200 cellules chez certaines espèces de haricots utilisés comme modèle d’étude.
Le rôle de cette structure cellulaire n’est pas seulement de maintenir physiquement l’embryon à l’intérieur de la graine mais également de contrôler son développement pendant l’embryogenèse en permettant le transfert de nutriments ou la synthèse d’hormones. Lors de la maturation de la graine, les cellules qui le composent rentrent dans un programme de mort cellulaire programmée. La couche cellulaire externe de l’embryon se différencie en protoderme formant le futur épiderme de l’embryon. Les cellules internes adoptent quant à elles un plan de division parallèle à l’axe apico-basal. L’embryon est alors au stade globulaire.

Développement de l’albumen

L’albumen est le tissu de réserve de la graine. Il provient de la division du zygote accessoire triploïde. L’albumen contribue à l’apport de nutriments à l’embryon pendant son développement mais aussi parfois pendant la germination. Chez les graines albuminées, comme les céréales, il est le lieu de stockage des réserves et persiste pendant le développement de la graine. Au contraire, chez les graines ex-albuminées comme celles d’Arabidopsis, l’albumen est éphémère et est presque entièrement absorbé par les cotylédons qui constituent alors le principal lieu de stockage des réserves. L’albumen se développe parallèlement à l’embryon : il est tout d’abord syncitial au début de l’embryogenèse puis cellularisé à partir de l’initiation des cotylédons au stade cœur. Après la double fécondation, les cellules de l’albumen sont transcriptionnellement plus actives que celles de l’embryon. Lors des premières phases de l’embryogenèse, des études ont montré que l’activité mitotique du noyau de l’albumen précède celui de l’embryon. Ces mitoses se déroulent sans cytokinèse ce qui donne naissance, chez Arabidopsis, à l’albumen syncitial constitué d’une seule cellule contenant environ 200 noyaux localisés principalement à la périphérie de l’albumen . Le rythme des divisions mitotiques plus rapide dans l’albumen que dans l’embryon pourrait être relié à l’absence de cytokinèse qui évite la synthèse de nouvelles membranes cellulaires. Le mécanisme inhibant la cytokinèse n’est pas encore connu .

Régulation de la teneur en oxygène dans les graines au cours de leur formation

La teneur en oxygène à l’intérieur de la graine résulte à la fois de la diffusion à travers le tégument depuis l’atmosphère et de la balance entre production et consommation.
Chez les dicotylédones, le tégument ne possède pas de stomate fonctionnel contrairement aux monocotylédones où quelques stomates sont présents. Le tégument limite donc les échanges des gaz entre la graine et le milieu extérieur. Une étude en tomographie de rayons X a montré qu’un réseau de canaux interconnectés à l’intérieur de la graine pourrait permettre le stockage transitoire d’oxygène .
La quantité d’oxygène à l’intérieur de la graine varie donc selon un gradient à partir du tégument jusqu’au centre de la graine. Ainsi, le niveau d’oxygène dans les graines de tournesol diminue progressivement dans l’albumen puis chute fortement dans l’embryon (Borisjuk et Rolletschek, 2009). Les biosynthèses fortement consommatrices d’oxygène, comme la synthèse des lipides par exemple, se déroulent donc dans la périphérie de la graine, là où l’oxygène est le plus présent. La plupart des études ont été menées chez le pois car la taille des graines est plus adaptée aux contraintes liées à ces techniques d’étude. Cependant, une hypoxie a également été mise en évidence chez Arabidopsis (Gibon et al., 2002) et chez Brassica napus.
Le tégument favorise à l’intérieur de la graine la création de condition d’hypoxie ou d’anoxie qui limitent la production d’ATP par les mitochondries. Chez la plupart des légumineuses et dans les graines oléagineuses des autres familles, l’embryon traverse une période photosynthétique transitoire (Rolletschek et al., 2005). Dans ces graines en formation, bien que la teneur en oxygène diminue graduellement du tégument à l’albumen, la teneur en oxygène à l’intérieur de l’embryon augmente lorsque la graine est éclairée . Le niveau d’oxygène dans ces graines dépend donc des conditions extérieures (lumière, pression d’oxygène) mais aussi du stade de développement. En absence de lumière, le niveau d’oxygène dans les graines photosynthétiques diminue fortement. La quantité d’oxygène disponible dans la graine en formation dépend alors uniquement des mécanismes de diffusion à travers le tégument. Cependant, un faible niveau d’oxygène est maintenu dans l’embryon. Ces observations suggèrent donc la mise en place de régulations pour empêcher l’anoxie.

La photosynthèse des graines

Chez la plupart des légumineuses et des graines à réserves oléagineuses, la maturation s’accompagne d’une période photosynthétique transitoire. La photosynthèse ne concerne pas nécessairement tous les tissus de la graine. Par exemple, chez le riz, le verdissement de la graine est localisé uniquement dans le tégument externe de la graine. Chez les dicotylédones, plus particulièrement chez les légumineuses et les graines à réserve lipidiques comme celles d’Arabidopsis thaliana, c’est l’embryon dans son intégralité qui devient vert et photosynthétiquement actif pendant le développement de la graine. La couleur verte d’une graine ou d’un de ses tissus n’est cependant pas toujours signe d’une activité photosynthétique. Par exemple chez le lotus sacré, aucune activité photosynthétique de l’axe de l’embryon, pourtant vert, n’est détectée .
La photosynthèse participe à l’accumulation des réserves dans la graine. L’activité photosynthétique des graines requiert la mise en place de chloroplastes fonctionnels au cours du développement produisant des réserves (synthèse d’amidon par exemple) ou des métabolites intermédiaires qui sont ensuite utilisés ou stockés par l’embryon. Les chloroplastes dans la graine proviennent de la différenciation de proplastes d’origine maternelle. Au stade globulaire, les plastes contiennent seulement quelques lamelles qui s’empilent au stade cœur et forment des grana au stade torpille. Chez Arabidopsis thaliana, le verdissement de l’embryon commence dès la fin de l’organogenèse (stade cœur). Il se développe progressivement de la périphérie de l’embryon jusqu’à son centre, entraînant l’acquisition de l’activité photosynthétique de la graine. Les graines sont donc totalement vertes pendant la phase de maturation .

Expression du génome nucléaire dans les graines en formation

Analyse globale : L’analyse globale de l’activité des gènes nucléaires au cours de la formation de la graine d’Arabidopsis thaliana a été réalisé par GeneChip (Le et al., 2010). Cette analyse a permis de mesurer les variations d’expression de 9 000 à 14 000 gènes et de 700 à 1 000 facteurs de transcription en fonction du stade de développement de la graine.
Le nombre d’ARNm détectés varie très peu après la fécondation et pendant les premiers stades d’embryogenèse mais diminue à partir du début de la maturation et lorsque la graine prépare son entrée en dormance. La même cinétique est observée pour les facteurs de transcription.
Chaque stade de développement est caractérisé par une population d’ARNm spécifique. De plus, la répartition de ces transcrits n’est pas homogène à l’intérieur de la graine. Par exemple, les ARNm spécifiques du stade globulaire de l’embryon sont localisés dans l’albumen ou le tégument de la graine tandis que ceux spécifiques du stade de maturation sont principalement localisés dans l’embryon. La comparaison de ces ARNm avec ceux d’une plante mature a permis de définir 289 gènes, dont 48 codant des facteurs de transcription (dont les gènes LEC et FUS3) qui sont spécifiques des graines en formation mais dont le rôle exact reste encore à préciser.
Expression des gènes nucléaires : pendant l’embryogenèse Les études de l’expression du génome nucléaire réalisées à partir d’embryons isolés montrent que jusqu’à 80 % des gènes du génome d’Arabidopsis thaliana sont exprimés pendant l’embryogenèse . Le profil et la fonction des gènes exprimés varient en fonction du stade de développement de l’embryon. Lors du passage du zygote au stade globulaire puis au stade cœur, les gènes les plus exprimés sont successivement ceux liés à l’auxine puis à la morphogenèse et au contrôle du cycle cellulaire. Dès le stade cœur, on note une augmentation de l’expression des gènes liés au métabolisme énergétique. Aux stades  «torpille» et «cotylédons retournés», les gènes du cycle cellulaire sont réprimés alors que les gènes liés à la croissance cellulaire et aux protéines de stockage sont activés.
Expression des gènes nucléaires pendant la maturation : Lors de la période de maturation, la graine accumule et stocke des réserves lipidiques, protéiques et glucidiques. L’analyse de l’expression des gènes participant aux voies de synthèse de ces différents composés réalisée par microarray chez Arabidopsis thaliana a révélé que le profil d’accumulation de chaque groupe de gènes est lié à leur fonction.

Partage de la transcription du génome plastidial par les systèmes NEP et PEP

Le génome plastidial est transcrit par deux systèmes enzymatiques différents. Tandis que la NEP transcrit la plupart des gènes de ménage, la PEP transcrit les gènes photosynthétiques. Afin de comprendre comment ces deux systèmes se partagent la transcription du plastome au cours du développement, plusieurs études ont caractérisé les cinétiques d’activité des deux systèmes enzymatiques dans la jeune plantule.
Ces observations et les caractéristiques des deux systèmes transcriptionnels avaient conduit Mullet en 1993 à émettre un modèle de fonctionnement séquentiel des polymérases. Ainsi, dans les premières phases de développement, le système NEP est actif et transcrit la plupart des gènes de ménage dont les sous-unités de la PEP. Dans les stades plus tardifs du développement, lors de l’apparition des tissus verts, la PEP devient active et transcrit alors les gènes liés à la fonction photosynthétique. Ce modèle ne rend cependant pas compte de toutes les observations. En effet, des études ont montré que dans des plantes dépourvues de PEP, tous les transcrits plastidiaux sont présents . Ces études révèlent donc que les NEP sont capables de transcrire tout le génome plastidial, peut-être par diminution de la spécificité des promoteurs PEP ou bien par la synthèse de très longs transcrits qui subissent ensuite une maturation. De plus, le modèle de Mullet a depuis été contredit par les résultats obtenus dans notre équipe par Emilie Demarsy démontrant que la PEP est présente et active pendant les phases précoces de la germination. En effet, l’inhibition spécifique de la PEP par la tagétine entraîne un retard de germination des graines traitées.
La compréhension des mécanismes du partage de l’activité transcriptionnelle entre les différents systèmes enzymatiques reste un point crucial. Il a été ainsi suggéré que le facteur de transcription SIG2 est un acteur de la transition entre l’activité NEP et l’activité PEP au cours du développement. En effet, in vitro le transcrit trnE, dépendant du complexe enzymatique PEP-SIG2, peut se lier directement à la NEP RPOTP et inhiber son activité. L’activité de la NEP pourrait donc être stoppée ou diminuée dès la synthèse de cet ARNt dans les premiers stades de développement .

Table des matières

INTRODUCTION
A – Physiologie de la graine en formation 
I. Double fécondation
I-1. Pollinisation et formation du tube pollinique
I-2. Fécondation
II. Embryogenèse 
II-1. Phase précoce de l’embryogenèse
II-2. Organogenèse de l’embryon
II-3. Développement de l’albumen
II-4. Régulation de l’embryogenèse
II-4-1. Régulations hormonales
II-4-2. Régulations transcriptionnelles
II-4-3. Contrôle maternel de l’embryogenèse
II-5. Transition vers la phase de maturation
III. Maturation 
III-1. Accumulation des réserves
III-1-1.Glucides
III-1-2.Protéines
III-1-3.Lipides
III-2. Régulation de la teneur en oxygène dans les graines au cours de leur formation
III-3. La photosynthèse des graines
III-4. Fin de la maturation
III-4-1. Dessiccation
III-4-2. L’induction et le maintien de la dormance
III-5. Régulation hormonale et transcriptionnelle de la maturation de la graine
IV. Levée de dormance et germination
B – EXPRESSION GÉNIQUE DANS LES GRAINES EN FORMATION 
I. Expression du génome nucléaire dans les graines en formation
I-1. Analyse globale
I-2. Expression des gènes nucléaires pendant l’embryogenèse
I-3. Expression des gènes nucléaires pendant la maturation
I-3-1. Transcrits liés aux réserves lipidiques
I-3-2. Transcrits liés aux protéines de réserve
I-3-3. Transcrits liés aux réserves glucidiques
I-3-4. Transcrits des gènes codant les fonctions photosynthétiques
II. Le génome plastidial 
II-1. Structure du génome plastidial
II-1-1. De nombreux plastomes ont été séquencés
II-1-2. Les plastomes possèdent une séquence inversée-répétée de longueur variable
II-1-3. Le génome plastidial est présent en de nombreuses copies dans les plastes
II-1-4. Le génome plastidial n’est pas uniquement circulaire
II-1-5. Les plastomes sont regroupés en nucléoïdes attachés aux membranes plastidiales
II-2. Organisation fonctionnelle
II-2-1. Le génome plastidial est organisé en opérons
II-2-2. Régulation de l’expression du génome plastidial
II-2-3. Fonction des gènes plastidiaux
II-2-4. La communication entre le noyau et le plaste
II-3. Transcription du génome plastidial
II-3-1. Système transcriptionnel PEP
II-3-2. Système transcriptionnel NEP .
II-3-3. Partage de la transcription du génome plastidial
par les systèmes NEP et PEP
PRESENTATION DU PROJET
CHAPITRE 1 EXPRESSION DU GÉNOME PLASTIDIAL D’ARABIDOPSIS THALIANA
PENDANT LA FORMATION DE LA GRAINE
I. Etablissement du système expérimental 
I-1. Définition des stades de développement de la graine
I-1-1. Stade d’embryogenèse (DAF 1/4)
I-1-2. Stade de maturation (DAF 5/12)
I-1-3. Stade de dessiccation (DAF 13/17)
I-1-4. Stade graine sèche (stade 0)
I-2. Caractérisation biochimique et moléculaire des stades
II. Expression des composants de l’appareil transcriptionnel plastidial pendant la formation de la graine 
II-1. Accumulation des transcrits
II-1-1. Transcrits NEP
II-1-2. Transcrits PEP et facteurs sigma
II-2. Accumulation des protéines
II-2-1. Accumulation des protéines NEP
II-2-2. Accumulation des protéines PEP et des facteurs sigma
II-2-3. Vérification du profil d’accumulation des protéines de l’appareil transcriptionnel plastidial
II-2-4. Corrélation entre l’accumulation des transcrits plastidiaux et l’accumulation de leur protéines
au cours de la formation des graines
II-3. Analyse de l’expression de transcrits plastidiaux par extension d’amorce et RT-PCR semi quantitative
II-3-1. Activité des NEP pendant le développement de la graine
II-3-2. Activité de la PEP pendant le développement de la graine
III. Analyse globale du transcriptome plastidial pendant la formation des graines
III-1. Conditions expérimentales
III-2. Méthode d’analyse des données
III-3. Analyse globale de l’accumulation des transcrits plastidiaux
III-4. Expression des transcrits plastidiaux photosynthétiques
III-5. Expression des transcrits plastidiaux de la classe « Transcription »
III-6. Expression des transcrits plastidiaux de la classe « Traduction »
III-7. Expression des transcrits de la fonction de chlororespiration
III-8. Expression des autres transcrits plastidiaux
III-9. Expression des transcrits antisens plastidiaux
IV. Discussion et conclusion 
CHAPITRE II MISE AU POINT D’UNE MICROMÉTHODE DE DÉTECTION DES ADNc
I. Présentation du projet
II. Principe de la technique optique utilisée
III. Mise au point de la méthode
III-1. Choix des gènes et design des amorces
III-2. Plan de dépôt des oligonucléotides
III-3. Marquage et hybridation
III-3-1.Choix du fluorophore pour le marquage
III-3-2. Détermination de la quantité optimale de fluorophore pour la rétro-transcription
III-3-3. Réaction de rétrotranscription, purification des ADNc néosynthétisés et hybridation sur les lames de quartz
IV. Résultats préliminaires 
IV-1. Rendement d’incorporation des dCTP fluorescents
IV-2. Evaluation de la qualité de l’hybridation
IV-2-1. Calibration spatiale de la caméra et précision du spotting
IV-2-2. Forme des dépôts
IV-2-3. Quantification du signal
IV-3. Comparaison de la quantification des transcrits par hybridation sur macroarray, sur lame et par qRT-PCR
V. Discussion et conclusion 
CHAPITRE III CARACTÉRISATION DE LA PHOTOSYNTHÈSE EMBRYONNAIRE DE LA GRAINE D’ARABIDOPSIS THALIANA
I. Spécificité anatomique des plastes dans les graines et conditions physicochimiques à l’intérieur de la silique 
I-1. Morphologie des cellules photosynthétiques et des plastes de graines et de feuilles
I-2. Conditions lumineuses à l’intérieur de la silique
I-3. Disponibilité des gaz à l’intérieur de la silique
I-3-1. Oxygène
I-3-2. Dioxyde de carbone
II. Comparaison des transcriptomes plastidiaux des graines et des feuilles
II-1. Analyse globale du transcriptome
II-2. Expression des transcrits photosynthétiques plastidiaux
II-3. Expression des autres transcrits plastidiaux
III. Organisation des complexes photosynthétiques dans les graines et les feuilles 
III-1. Accumulation des protéines des complexes photosynthétiques
III-2. Fonctionnalité des complexes photosynthétiques
III-2-1. Teneur en chlorophylles
III-2-2. Stœchiométrie des photosystèmes
III-2-3. Couplage des photosystèmes et des antennes collectrices
III-4. Mesure de l’activité photosynthétique
III-4-1. Activité photosynthétique
III-4-2. Mécanisme de photoprotection
IV. Importance de la photosynthèse embryonnaire sur le développement de la graine et la vigueur germinative
IV-1. Influence de l’inhibition de la photosynthèse embryonnaire sur la formation des graines et leur vigueur germinative
IV-2. Influence de l’inhibition des photorécepteurs sur la vigueur germinative de la graine
V. Discussion et conclusion 
CONCLUSION
MATÉRIEL ET MÉTHODES
I. Obtention du matériel végétal 
I-1. Stérilisation en surface des graines d’Arabidopsis thaliana
I-2. Culture sur terre d’Arabidopsis thaliana
I-3. Test de germination
I-4. Récolte des graines
I-5. Stockage des graines
I-6. Préparation des échantillons pour observation en microscopie électronique
II. Extraction et dosage des pigments
II-1. Dosage rapide des chlorophylles
II-2. Extraction des pigments
III. Méthode d’analyse des acides nucléiques
III-1. Séparation des acides nucléiques sur gel d’agarose
III-2. Extraction rapide d’ADN génomique d’Arabidopsis thaliana
III-3. Extraction d’ARN
III-3-1. Broyage du matériel végétal
III-3-2. Extraction des ARN
III-3-3. Précipitation, lavage et dosage des ARN
III-4. Traitement des ARN à la DNAse
III-5. Analyse des ARN par rétro-transcription et PCR semi-quantitative
III-5-1. Synthèse du premier brin d’ADNc
III-5-2. Amplification des ADNc par PCR semi-quantitative
III-6. Analyse des ARN par extension d’amorce
III-6-1. Marquage de l’oligonucléotide amorce et du produit PCR
III-6-2. Marquage du marqueur de taille
III-6-3. Réaction d’extension d’amorce
III-7. Analyse des ARN par hybridation sur macroarray
III-7-1. Synthèse des ADNc par rétrotranscription et marquage au 32P
III-7-2. Purification des ADNc
III-7-3. Hybridation des ADNc sur les membranes
III-7-4. Analyse informatique des résultats de macroarray
IV. Méthode d’analyse des protéines 
IV-1. Extraction de protéines
IV-2. Dosage de protéines
IV-3. Séparation monodimensionnelle des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE)
IV-4. Coloration des protéines au bleu de Coomassie
IV-5. Transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose
IV-6. Immunodétection
V. Techniques de clonage et de surexpression de protéines – Gateway
V-1. Principe du clonage
V-2. Vecteurs et souches utilisés
V-2-1. Vecteur pDONR221
V-2-2. Vecteur pDEST17
V-2-3. Souche E.coli DH5α
V-2-4. Souche E.coli BL21-AI
V-3. Préparation des fragments d’ADN
V-3-1. Amplification par PCR du fragment à cloner
V-3-2. Purification des produits amplifiés par PCR
V-3-3. Séquençage
V-4. Construction du vecteur d’expression
V-4-1. Première recombinaison : produit PCR – vecteur d’entrée (pDONR21)
V-4-2. Seconde recombinaison : clone d’entrée – vecteur d’expression (pDEST17)
V-5. Transformation
V-6. Préparation de plasmide
V-7. Production de protéines recombinantes
V-7-1. Préparation des extraits bruts
V-7-2. Préparation de la protéine recombinante
V-8. Obtention des anticorps
V-9. Caractérisation des anticorps
VI. Méthodes d’analyse de la photosynthèse
VI-1. Mesure de l’activité de la chaîne de transfert d’électrons
VI-2. Principe de l’Electro Chromic Shift (ECS) et utilisation
VI-3. Enregistrement des spectres d’émission, d’absorption et des spectres à basse température
RÉFÉRENCES 
ANNEXES

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