Expérimentation animale

Expérimentation animale

Le modèle expérimental choisi pour la réalisation des études a été la souris c57bl/6j. C’est un modèle couramment utilisé en laboratoire susceptible de développer à la fois le diabète et l’obésité par des interventions nutritionnelles (Loustau et al., 2020; Petro et al., 2000; Shafrir and Ziv, 2009). Les expérimentations ont été réalisées sur des souris c57bl/6j âgées de 8 semaines (n=110) et ont été hébergées en animalerie dans des conditions contrôlées avec un cycle de 12 heures lumière-obscurité, avec une humidité avoisinant les 60% ainsi qu’une température d’environ 21 °C. Les souris ont eu un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les souris ont été acclimatées 2 semaines afin de débuter les protocoles à l’âge de 10 semaines. Le protocole d’étude est résumé sur le schéma présenté ci-dessous (Figure 19) :  Ce régime obésogène a été appliqué durant 10 semaines afin d’induire un phénotype obèse chez les souris c57bl/6j. S’en est suivie, une randomisation des souris HFS dans différents groupes où la supplémentation en vitamine D et l’exercice physique vont être ajoutés à la nourriture HFS :  L’apport alimentaire, que ce soit de la nourriture ou de la consommation de boisson, a été évalué à chaque renouvellement dans les cages, à raison de 3 fois par semaine. Grâce aux mesures de la prise alimentaire, le contrôle de la supplémentation en vitamine D a pu être réalisé. Les résultats sont présentés en Annexe.

Les mesures du suivi de l’homéostasie glucidique et de la vitesse maximale aérobie ont été réalisées : avant la mise en place du régime obésogène (T0), avant la mise en place des supplémentations (T10), au milieu des supplémentations (T17) et à la fin du protocole (T24). Le suivi de l’homéostasie glucidique a été réalisé par le test de tolérance à l’insuline sur des souris mises à jeun 6 heures avant le début des mesures. Par une incision en bout de queue des animaux, les prélèvements sanguins ont pu être réalisés afin d’obtenir la glycémie avec le lecteur à bandelettes (CareSens NTM, Dinno Santé, La vitesse maximale aérobie (VMA) a été réalisée sur des tapis de courses où les souris ont eu un échauffement de 6 minutes à une vitesse de 7m.min-1 puis de niveaux croissants de 4m.min-1 toutes les 1’30 minutes. La VMA est atteinte lorsque les souris n’étaient plus capables de suivre la vitesse du tapis. Le palier précédent est alors considéré comme maximal.  A la fin des 25 semaines de protocole, les souris ont été mises à jeun d’environ 12 heures puis anesthésiées par inhalation d’un mélange à 4% d’isoflurane (IsoFloTM, Zoetis, Parsippany, Etats-Unis) afin de réaliser un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque sur seringue héparinée (S-Monovette®, Sarsted, Nümbrecht, Allemagne). Après centrifugation, le plasma a été aliquoté et congelé à -80°C avant analyse.

Les souris ont ensuite été mises à mort par dislocation cervicale et les différents organes, cœur, foie, et rein ont été prélevés et pesés. L’ensemble des tissus adipeux épididymal, sous-cutané, inguinal, périrénal et brun ont été prélevés et pesés. Les muscles soléaire et gastrocnémien ont également été prélevés. En guise d’indicateur, la rate a été prélevée et pesée afin d’évaluer le statut inflammatoire des souris. Si celui-ci est trop élevé, la souris est exclue. Ces différents tissus ont été soient fixés dans la formaline puis rincés dans du tampon phosphate alcalin et conservés dans l’éthanol à 70% à +4°C pour analyse histologique soient congelés dans l’azote liquide et conservés à -80°C pour analyse biochimique et moléculaire.  Les ARN totaux ont été extraits à partir de tissus congelés. Le tissu a tout d’abord été homogénéisé à l’aise d’un robot à billes (Retsch GmbH, Haan, Allemagne) dans 1 mL de TRI Reagent (Invitrogen) permettant la lyse des cellules tout en préservant l’intégrité des molécules d’ADN et d’ARN. Les échantillons ont ensuite été mélangés à 200 µl de chloroforme afin de solubiliser les lipides et centrifugés pendant 15 minutes à 1500g et à +4 °C. La solution triphasée obtenue a permis de différencier la phase organique (ADN, protéines) de la phase aqueuse contenant l’ARN délimitée par une interface. La phase supérieure a été transférée dans un nouveau tube en présence de 500 µL d’isopropanol afin de précipiter les ARN. Ce mélange a été incubé 30 minutes à -20 °C et ensuite centrifugé pendant 15 minutes à 12000g et à +4 °C. Le surnageant obtenu a été éliminé puis le culot d’ARN est lavé deux fois avec 1 mL d’éthanol à 80% et centrifugés pendant 5 minutes à 7500g à +4 °C. Après évaporation complète, les culots ont été séchés avant d’être repris dans de l’eau RNAse free. La quantité et la pureté des ARN extraits ont été mesurées par spectrophotométrie (BioDrop µLITE, Isogen Life Science, Utrecht, Pays-Bas).