Exemples d’application de la micropropagation chez les myrtacée 

CONSERVATION DE LA FLORE

Les terrains exploités par le projet Ambatovy seront progressivement recouverts et reboisés par une forêt de remplacement afin de restaurer l’écosystème (http://4). En d’autre terme, l’objectif environnemental du projet Ambatovy est que toutes activités menées collectivement ne devraient causer aucune perte nette pour l’héritage naturel de Madagascar mais de préférence un gain net (http://6).
La régénération in vitro, un outil de la biotechnologie, fait partie de l’une des techniques employées par le projet Ambatovy pour arriver à cette fin.

DEFINITIONS ET CONDITIONS REQUISES POUR LAMICROPROPAGATION

La micropropagation est un outil de la régénération in vitro. C’est une technique qui permet de multiplier les plantes de manière végétative sur un milieu de culture synthétique.
Elle est également définie comme culture de différents types de cellules somatiques, tissus, organes végétaux dans des conditions parfaitement contrôlées (milieux de culture définis pour chaque type de plante, température, lumière, humidité,…) (Dobranszki et Teixeira da Silva, 2010 ; http://1). La lumière et la température dans l’environnement in vitro sont notamment des facteurs qui peuvent déterminer les besoins nutritionnels spécifiques à la culture de plante (Murashige, 1973). La micropropagation est principalement basée sur la totipotence cellulaire, autrement dit, la capacité de toute cellule végétale à régénérer une multitude d’individus qui lui est identique (White, 1963). Cela est due au fait que chaque cellule vivante d’un organisme pluricellulaire soit dotée de la capacité à se développer indépendamment dans des conditions [Généralités] convenables (White, 1963). Cette totipotence ou capacité des plantes mises en culture àproduire des cals, de nouveaux organes ou des embryons somatiques dépend notamment :
– de l’activité des gènes qui déterminent et maintiennent le fonctionnement des cellules ;
– du taux de régulateurs de croissance dans les cellules ;
– de la sensibilité des cellules aux hormones (Demarly et Sibi, 1996).
Par ailleurs, la culture in vitro requiert des conditions d’asepsie pour les explants et les matériels utilisés (White, 1963).

MILIEU DE CULTURE

Généralement, les composants des milieux de culture varient selon les espèces et les explants cultivés. Cependant, tous les milieux de culture, liquides ou solides, doivent contenir tous les éléments fondamentaux à la culture in vitro, incluant : les sels minéraux inorganiques (macroéléments et microéléments), les régulateurs de croissance et les constituants organiques (sucre, vitamines, acides aminés) (Murashige, 1973). A ces éléments peuvent s’ajouter facultativement des complexes naturels (lait de coco vert, extrait de malt, jus de tomate, jus d’orange, …), de l’agent gélifiant (Phytagar, Difco-Bacto, TC Agar, Agarose, Hydrogels, …) et du charbon actif (Murashige, 1973 ; http://7).

Sels minéraux inorganiques

Macroéléments

Guadinovà (1983) a confirmé que la déficience en un macroélément peut influencer significativement le système enzymatique ou système d’assimilation. Les macroéléments regroupent les nutriments nécessaires en concentration importante pour le développement des plantes, à savoir : l’azote (N), le calcium (Ca), le potassium (K), le soufre (S), le magnésium (Mg) et le phosphore (P) (http://7).

Microéléments

Parmi ces éléments, on peut citer le fer (Fe), le bore (B), le manganèse (Mn), le zinc (Zn), l’iode (I), le molybdène (Mo), le cuivre (Cu), le cobalt (Co), le chlore (Cl) (http://1, http://7). Ils sont nécessaires au développement de la plante, mais employés à de faibles quantités, d’où leur appellation « oligoéléments » (Boxus, 1995).

Constituants organiques

Sucre

C’est un élément très essentiel grâce à sa capacité de pouvoir substituer le CO2 et de devenir ainsi une source d’énergie et de carbone (George, 2008). Pour assurer la survie et le développement de l’explant, le sucre est utilisé pour compenser une assimilation chlorophyllienne insuffisante ou nulle dans les conditions in vitro (http://1). Parmi les classes de sucres, on peut citer le glucose, le sucrose, le saccharose, le lactose et le maltose (George, 2008).

Vitamines

L’exigence des cellules sur l’ajout de vitamine dans le milieu de culture varie en fonction de la nature de l’espèce et du type de culture (George, 2008). Leur addition dans le milieu de culture améliore non seulement le développement de l’explant mais aussi renforce leur survie (Kaul et Sabharwal 1972 ; Kaul et Sabharwal, 1975 ; Staudt, 1984 ; Gupta et Durzan, 1985 ; Chée, 1995 ; Asano et al. , 1996).
La thiamine (Vit. B1 ou aneurine), l’acide nicotinique (niacine), la pyridoxine (Vit. B6) et le myo-inositol sont les vitamines fréquemment utilisées dans les milieux de culture (George, 2008).

Acides aminés

Les acides aminés peuvent être utilisés comme l’unique source d’azote (http://2). Les aminoacides les plus largement utilisés sont l’acide aspartique, l’asparagine, l’acide glutamique, la glutamine et l’arginine (http://7).

Régulateurs de croissance

Les phytohormones ou régulateurs de croissance sont des substances qui peuvent induire des réponses physiologiques (croissance et néoformation des organes) à de très faible concentration (http://1). Les cytokinines et les auxines sont les régulateurs de croissance les plus utilisés dans la vitropropagation (Murashige, 1973).

Cytokinines

La biosynthèse des cytokinines se fait essentiellement dans les extrémités racinaires et dans les jeunes fruits (Boxus, 1995). Elles agissent sur la division cellulaire en stimulant l’activité mitotique, la ramification des pousses herbacées (en s’opposant à la dominance apicale), l’organogenèse (la néoformation des bourgeons où elle interagit avec l’auxine), l’effet anti-sénescence (par la stimulation des synthèses de protéines) et le ralentissement de leur dégradation (Boxus, 1995 ; http://2).
Dans la micropropagation, les cytokinines sont très reconnues pour ses capacités à induire la formation des bourgeons adventifs (http://2). Les cytokinines les plus largement utilisées sont le 6-furfurylaminopurine, appelé aussi kinétine et le 6-benzylaminopurine (BAP) (Murashige, 1973).

Auxines

Pour le cas des auxines, leur synthèse se produit au niveau des zones de croissance (les primordias foliaires et les jeunes feuilles) et au cours de la maturation des graines. Par ailleurs, elles agissent entre autres sur la division et l’agrandissement cellulaire, la formation et l’élongation des racines, la maturation des fruits (Boxus, 1995).
Dans la vitropropagation, les auxines jouent des rôles essentiels sur la callogenèse, la rhizogénèse et l’induction de l’embryogenèse somatique (http://2). Le 2-4 dichlorophénoxyacétique (2,4-D), l’acide 1-naphtalène acétique (ANA) et l’acide indole-3-acétique (AIA) sont les auxines qui agissent le plus efficacement sur la stimulation de la croissance (Murashige, 1973). Le plus souvent, les auxines et les cytokinines sont utilisés en combinaison du fait de leur effet interactif considérable (Murashige, 1973).

Complexes naturels

Les complexes naturels les plus fréquemment employés sont le lait de coco vert, l’extrait de malt, l’extrait de levure, le jus, la pulpe ou l’extrait de fruit (orange, banane, tomate, …) et l’hydrolysat de protéine (La Rue, 1949 ; Steward et Shantz, 1959). Ces complexes peuvent être des sources d’aminoacides, de peptides, d’acides gras, de carbohydrates, de vitamines et de régulateurs de croissance (Murashige, 1973).

Exemple de complexe naturel : le lait de coco vert

Van Overbeek et al. (1941) ont été les premiers à avoir utilisé le lait de coco vert dans la culture de tissus. Ce qui leur a permis de découvrir que l’ajout de lait de coco vert dans le milieu de culture améliore le développement des jeunes embryons de Datura stramonium . Grâce aux éléments qui le composent (composition chimique en annexe n°1), le lait de coco vert joue un rôle important dans l’induction de la division cellulaire, dans l’induction du développement des cals et des suspensions cellulaires, ainsi que dans l’induction de la morphogenèse. La présence d’auxine, de cytokinine et de myo-inositol dans ce complexe est l’un des facteurs lui bénéficiant cette propriété (Pollard et al. , 1961 ; George, 2008).

Agent gélifiant

L’agent gélifiant sert principalement à solidifier le milieu de culture mais peut aussi chez certaines espèces favoriser leur développement (Murashige, 1973 ; Miller et Murashige, 1976 ; http://1). Toutefois, d’autres espèces se développent mieux sur des milieux liquides (Murashige, 1973 ; Miller et Murashige, 1976).

Charbon actif

C’est un élément très souvent employé dans la vitropropagation pour améliorer la croissance et le développement (Pan et Van Staden, 1998). L’utilisation du charbon actif repose le plus souvent sur sa propriété détoxifiante (http://2). Le charbon actif est impliqué dans certaines activités stimulatrices et inhibitrices. La présence de charbon actif dans le milieu de culture induit l’amélioration de la croissance, la modification et l’opacité du milieu de culture, l’adsorption de vitamines, d’ions métalliques et de régulateurs de croissance incluant l’acide abscissique et l’éthylène (Dennis Thomas, 2008). Ces caractéristiquesattribuent au charbon actif la capacité d’absorber irréversiblement les composés inhibiteurs présents dans le milieu de culture et de réduire les métabolites toxiques et les exsudats phénoliques. De plus, chez de nombreuses espèces, le charbon actif peut induire la rhizogénèse des pousses in vitro, en présence ou non de l’auxine (Dennis Thomas, 2008).

SITE DE RECOLTE DES SAUVAGEONS

SITUATION GEOGRAPHIQUE

Les deux espèces Eugenia sp.nov.1 et Syzygium parker i ont été récoltées dans la forêt dense humide et sempervirente du site d’exploitation minière d’Ambatovy. Ce site est situé dans le Centre-Est de Madagascar, dans le district de Moramanga, Région Alaotra Mangoro. Géographiquement, il est localisé entre la longitude Est 48° 18’ 00’’ et la latitude Sud 18° 49’ 0,12’’ (http://10) (carte 1).

CLIMAT

Le site d’exploitation minière d’Ambatovy est caractérisé par un climat tropical humide. Sa précipitation moyenne annuelle est de 1400mm. Les mois les plus pluvieux du site s’étendent entre le mois de décembre et le mois de mars. Quant à la température, juillet constitue le mois le plus froid tandis que le mois le plus chaud est le mois de février (figure 1). En outre, la température moyenne annuelle du site est de 17°C (http://10). Les données sur les températures moyennes et les pluviométries mensuelles du site minier d’Ambatovy sont en annexe 2. La carte de la pluviométrie moyenne de Madagascar se trouve en annexe 3.

DESCRIPTIONS MORPHOLOGIQUES

Du point de vue morphogénique, la famille des Myrtaceae est caractérisée par des buissons à grands arbres hermaphrodites (ou rarement des fleurs uniquement mâles chez Eugenia), des tiges et des écorces souvent teintées de rougeâtre. Par ailleurs, ses feuilles sont opposées ou rarement simples (chez Eucalyptus), entières, penninerves ou rarement à nervures longitudinales. Ses inflorescences sont souvent axillaires ou terminales, ou parfois cauliflores. Par contre, ses fruits se présentent sous forme de petite à grande baie charnue contenant une graine indéhiscente, ou sous forme de capsule sèche contenant de multiples graines déhiscentes (Perrier de la Bâthie, 1952 et 1953 ; Scott, 1980).

Eugenia sp.nov.1

C’est un arbre aux branches souvent teintées de rougeâtre. Il est caractérisé par des feuilles entières, opposées décussées, plus rétrécies au sommet (photo 1). Ses fruits sont de petites à grandes baies charnues (photo 2), indéhiscentes, contenant 1 à 3 graines renfermant des cotylédons partiellement à entièrement soudés. Contrairement à Syzygium , Eugenia se diffère par ses inflorescences axillaires ou cauliflores réduites, ses fleurs aux pétales entièrement libres et généralement de couleur rose (photo 1) (Perrier de la Bâthie, 1952).

Syzygium parkeri

Arbre de 15 à 25m de haut, à feuilles entières, de 4 à 12mm, coriaces, opposées décussées, plus élargies au sommet (pour les feuilles adultes) (photo 4). Son inflorescence est feuillée à la base dont l’ensemble plus ou moins dense peut atteindre 10cm en long et en large. Ses fleurs généralement de couleur blanche et pouvant atteindre 10mm de long, contiennent environ 30 étamines qui dépassent largement le calice de 5mm (photo 3). Ses fruits globuleux, petits, de 6 à 8mm de diamètre (photo 4), sont violets à maturité (Perrier de la Bâthie, 1952).

REGENERATION DES PLANTES

Stérilisation de surface des explants

Les explants utilisés ont été issus des sauvageons déjà élevés dans la serre du Laboratoire de Physiologie Végétale. Ils ont été constitués de microboutures de 2 à 3cm comportant 1 nœud (photo11). La désinfection des microboutures d’Eugenia sp.nov.1 et de Syzygium parkeri a été identique et effectuée sous hotte à flux laminaire (photo 12). La figure 2 résume le protocole de désinfection des microboutures d’Eugenia sp.nov.1 et de Syzygiumparkeri .

Multiplication et enracinement in vitro

Milieu de culture

Les milieux de culture pour la multiplication et l’enracinement (milieux C) ont été constitués de milieu de base, additionnés de 90mg/l de NaH2PO4 et de combinaisons de régulateurs de croissance. Parmi les milieux C, du milieu de culture dépourvu de régulateurs de croissance (milieu C0) a été également utilisé. Le milieu témoin (L0) a été constitué de milieu de base uniquement.
Sous hotte à flux laminaire (photo 13), les explants ont été transférés dans un milieu de culture contenant une combinaison de BAP et d’ANA. Pour la multiplication, les concentrations de BAP et d’ANA utilisées ont été variées de 1 à 3mg/l et de 0 à 0,5mg/l. Les milieux d’enracinement ont été additionnés de 0,5 à 3mg/l de BAP et de 0 à 0,5mg/l d’ANA.

Acclimatation des plantules

Les plantules pourvues de racines ont donc été transférées à la serre afin de passer à la phase d’acclimatation. Le substrat a été constitué d’un mélange de litière et de terre rouge à avec la proportion de 1/3 ; 2/3.
Avant leur transfert sur le substrat, les racines des plantules ont été lavées à l’eau de robinet pour enlever les traces d’agar tout en évitant de les frotter afin de prévenir des dommages au niveau des poils absorbants. Les plantules transférées ont été tout de suite recouvertes deux à deux par un sac en plastique transparent, permettant ainsi de les maintenir dans des conditions les plus semblables possibles à celles de la salle de culture (humidité de l’air, température et luminosité) (Photo 14). Sous couverture, les plantules ont été arrosées régulièrement tous les deux jours.
Des tests sur la durée de la première aération variant de 5, 7, 9 à 11 jours ont été menés afin de déterminer la durée de l’acclimatation et le taux de réussite. A chaque intervalle de 3 jours, la couverture a été retirée progressivement de 3cm. Douze jours après la première aération, la couverture a été entièrement enlevée, laissant ainsi les plantules en contact direct avec l’air libre de la serre. La figure 3 récapitule les étapes suivies pour l’acclimatation des plantules d’Eugenia sp.nov.1 et de Syzygium parkeri .
Pour chaque traitement (A1, A2, A3, A4), 20 plantules ont été utilisées, soit un total de 80 plantules pour chaque espèce.

INFLUENCES DE LA DUREE DE TREMPAGE ET DES CONCENTRATIONS DE CaOCl 2 SUR LA STERILISATION DE SURFACE DES EXPLANTS D’Eugenia sp.nov.1 ET DE Syzygium parkeri

Les effets des différents traitements utilisés pour la désinfection des explants d’Eugenia sp.nov.1 et de Syzygium parkeri sont regroupés dans le tableau 4.

TAUX DE CONTAMINATION

D’après le tableau 4, les réactions des deux espèces vis-à-vis des traitements de désinfection ont été similaires. Le taux de contamination des explants traités avec l’hypochlorite de calcium (CaOCl2 ) a été inversement proportionnel à la durée de trempage.
L’utilisation du CaOCl2 à 7% durant 15mn (T4) a permis d’obtenir les plus faibles taux de contamination. Ces taux ont été respectivement de 10,6% pour Eugenia sp.nov.1 et de 10,3% pour Syzygium parkeri . Par contre, il y a eu une augmentation du taux de contamination de 20,6% pour Eugenia sp.nov.1 et de 20% pour Syzygium parkeri quand la durée de trempage dans le CaOCl2 a été diminuée à 10mn (T3).
Pour la stérilisation au CaOCl2 5% pendant 15mn (T2), le pourcentage d’explants contaminés a augmenté à 30,3% pour Eugenia sp.nov.1 et à 30,6% pour Syzygium parkeri .
Une durée de trempage de 10mn avec la même concentration (T1) a provoqué davantage une augmentation du taux de contamination jusqu’à 40% pour Eugenia sp.nov.1 et jusqu’à 40,3% pour Syzygium parkeri .
D’après les résultats, l’augmentation de la concentration de CaOCl2 (de 5% à 7%) et de la durée de trempage (de 10min à 15 min) a diminué le taux de contamination jusqu’à 10% en moyenne chez les deux espèces.

TAUX DE MORTALITÉ

Les résultats obtenus dans le tableau 4 indiquent que quelle que soit la concentration en CaOCl2 (5% ou 7%), un taux de mortalité nul a été constaté lorsque la durée de trempage a été de 10mn (T1 et T3).
Par ailleurs, ces résultats ont démontré que l’espèce Eugenia sp.nov.1 a été plus sensible que Syzygium parkeri vis-à-vis de l’action de CaOCl2 . Chez Syzygium parkeri , seul le traitement avec du CaOCl2 à 7% durant 15mn (T4) a provoqué la mort de 20,6% d’explants. Néanmoins, chez Eugenia sp.nov.1, pour chaque concentration de CaOCl2 (5% et 7%), ladurée de trempage de 15mn (T2 et T4) a conduit à la mort de 10% et de 40,3% des explants.
Les analyses statistiques ont permis de démontrer que le taux de mortalité des explants augmente en fonction de la concentration de CaOCl2 et de la durée de trempage des explants.
En effet, pour les deux espèces, le traitement T3 a été le plus efficace puisqu’il a permis d’obtenir le taux le plus élevé d’explants viables, c’est-à-dire, les plus faibles taux de contamination (20,6% pour Eugenia sp.nov.1 et 20% pour Syzygium parkeri ) et de mortalité (0% pour les deux espèces).

Table des matières

REMERCIEMENTS
GLOSSAIRE
LISTE DES ABREVIATIONS
INTRODUCTION 
1 ère partie : GENERALITES
I. PROJET AMBATOVY
I.1. PLAN DE GESTION DE LA BIODIVERSITE DE L’EXPLOITATION MINIERE D’AMBATOVY
I.2. CONSERVATION DE LA FLORE
II. DEFINITIONS ET CONDITIONS REQUISES POUR LA MICROPROPAGATION
II.1. DEUX VOIES DE LA MICROPROPAGATION
II.2. ETAPES DE LA MICROPROPAGATION
II.3. MILIEU DE CULTURE
II.3.1. Sels minéraux inorganiques
II.3.2. Constituants organiques
II.3.3. Régulateurs de croissance
II.3.4. Complexes naturels
II.3.5. Agent gélifiant
II.3.6. Charbon actif
II.4. EXEMPLES D’APPLICATION DE LA MICROPROPAGATION CHEZ LES MYRTACEAE
III. EXEMPLES DE RECHERCHES EFFECTUEES SUR LES MYRTACEAE POUR SES PRINCIPES ACTIFS
2ème partie : MATERIEL ET METHODES 
I. SITE DE RECOLTE DES SAUVAGEONS
I.1. SITUATION GEOGRAPHIQUE
I.2. CLIMAT
II. MATERIEL VEGETAL
II.1. CLASSIFICATION BOTANIQUE
II.2. DESCRIPTIONS MORPHOLOGIQUES
II.3- REPARTITION
III. METHODES
III.1. PRÉPARATION DES MILIEUX DE CULTURE
III.2- REGENERATION DES PLANTES
III-2-1- Stérilisation de surface des explants
III-2-2- Multiplication et enracinement in vitro
III-2-3- Acclimatation des plantules
III.3- TRAITEMENT DES RESULTATS
3ème partie : RESULTATS ET INTERPRETATIONS 
I- INFLUENCES DE LA DUREE DE TREMPAGE ET DES CONCENTRATIONS DE CaOCl2 SUR LA STERILISATION DE SURFACE DES EXPLANTS D’Eugenia sp.nov.1 ET DE Syzygium parkeri
I-1- TAUX DE CONTAMINATION
I-2- TAUX DE MORTALITÉ
II- MULTIPLICATION
II-1- INFLUENCES DES REGULATEURS DE CROISSANCE ET DU NaH 2PO4 SUR LE NOMBRE DE POUSSES FORMÉES
II-2- INFLUENCES DES REGULATEURS DE CROISSANCE ET DU NaH 2PO4 SUR L’ÉLONGATION DES POUSSES
III- RHIZOGENESE
IV- ACCLIMATATION
4 ème partie : DISCUSSIONS 
I- ETABLISSEMENT D’UNE CULTURE ASEPTIQUE
II- MULTIPLICATION
II-1- INFLUENCES DES REGULATEURS DE CROISSANCE SUR LE NOMBRE DE POUSSES FORMEES
II-2- INFLUENCES DU NaH 2PO4 SUR LE NOMBRE DE POUSSES FORMÉES
II-3- INFLUENCES DES REGULATEURS DE CROISSANCE SUR L’ELONGATION DES POUSSES
II-4- INFLUENCES DU NaH 2PO4 SUR L’ELONGATION DES POUSSES
III- ENRACINEMENT
IV- ACCLIMATATION
CONCLUSION ET PERPECTIVES 
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 
REFERENCES WEBOGRAPHIQUES
ANNEXES