Excitation de la fluorescence en réflexion totale interne 

Excitation de la fluorescence en réflexion totale interne 

Mise en forme du faisceau excitateur

La source excitatrice utilisée est la source laser supercontinuum présentée dans le chapitre précédent (p 81). La sortie fibrée de cette source est positionnée directement à la hauteur d’entrée du faisceau dans le microscope, pour faciliter l’alignement en travaillant dans un unique plan horizontal et ainsi éviter d’avoir à utiliser un périscope. Les deux miroirs de renvoi M1 et M2, réfléchissants dans le visible, servent d’une part à s’affranchir de toute réinjection infrarouge dans l’oscillateur (voir la caractérisation de la source dans le chapitre précédent) et d’autre part à retrouver l’alignement en cas de déplacement de la source. Après le miroir M2, les fuites dans l’infrarouge sont récupérées (visible sur la photo mais pas sur le schéma) et envoyées, par l’intermédiaire d’un miroir, sur une photodiode pour récupérer le train d’impulsions du laser, qui va nous servir de signal de référence pour synchroniser la détection temporelle. La densité optique ajustable (roue avec une densité continûment variable de 0 à 4) permet de maîtriser la puissance laser incidente sur l’échantillon. Pour mesurer la puissance incidente dans  les gammes spectrales où la puissance de la source varie, nous plaçons le filtre à l’excitation après la densité optique, et un miroir escamotable placé juste après le filtre à l’excitation renvoie le faisceau sur un puissancemètre (non représenté sur le schéma). Connaissant la transmission des optiques jusqu’à l’échantillon, on peut ainsi évaluer précisément la puissance incidente sur l’échantillon et par conséquent ajuster la valeur de la densité optique pour avoir la puissance souhaitée. Dans des régions du spectre d’émission de la source où la densité spectrale ne varie que très peu, le filtre à l’excitation est placé directement dans le cube dans le microscope, juste avant l’objectif. Les deux lentilles L1 et L2 forment un afocal qui permet d’élargir le faisceau excitateur d’un facteur 30 10 300 = . Cet élargissement est nécessaire pour avoir au niveau de l’échantillon une zone d’excitation assez large. Nous avons sélectionné ce facteur 30 pour que la zone de l’échantillon imagée soit excitée d’une manière uniforme, bien entendu sans trop étaler le faisceau pour avoir un éclairement suffisant et ne pas créer de diffusion de l’excitation dans le reste de l’échantillon. Deux autres miroirs (le miroir M3 et un autre non représenté sur le schéma) sont utilisés pour replier le faisceau et garantir l’accessibilité aux différentes parties du montage. De même des diaphragmes, apparents sur la photo mais non représentés sur le schéma, sont utilisés pour retrouver l’alignement, mais également pour couper la partie périphérique du faisceau, partie inhomogène à cause des aberrations chromatiques de la lentille à l’extrémité de la fibre du laser.

Procédure d’alignement pour générer le champ évanescent

Le miroir M4T et la lentille L3 (associés à l’objectif, qui est présenté dans l’annexe 1) sont les éléments qui nous permettent de réaliser une excitation en réflexion totale interne. La lentille L3 permet de focaliser le faisceau excitateur dans le plan focal arrière de l’objectif. Son positionnement est assez délicat. En effet, elle doit se situer à la bonne distance pour focaliser le faisceau excitateur dans le plan focal de l’objectif, et elle doit être centrée pour ne pas introduire d’aberrations qui créeraient des inhomogénéités supplémentaires dans le champ évanescent. Pour faciliter l’alignement, nous utilisons un rail qui nous garantit le centrage de la lentille par rapport à l’axe défini par le microscope, et qui nous permet d’avancer ou de reculer la lentille pour bien focaliser l’excitation dans le bon plan. Concrètement, le positionnement de la lentille est réalisé en observant la tâche produite par le faisceau excitateur après l’objectif. Si la lentille est bien centrée, normale au faisceau, elle va induire peu d’aberrations, et donc en défocalisant l’objectif, on doit voir une tâche qui reste à symétrie circulaire. Si la lentille est à la bonne distance, pour une position de l’objectif correspondant à sa position lors de l’acquisition (i.e. avec une mise au point réglée à l’interface lamelle-échantillon), la tâche « à l’infini », c’est-à-dire projetée au plafond sera la plus petite possible (idéalement de la taille de la pupille de sortie de l’objectif puisque le faisceau doit être collimaté). Bien entendu, vue la faible ouverture numérique de la lentille L3 nous permettant de focaliser, la tâche dans le plan focal arrière n’est pas ponctuelle, et donc la collimation n’est pas parfaite. Mais on l’optimise en réglant la position de cette lentille. Le miroir M4T quant à lui nous permet de modifier l’angle d’incidence du faisceau sur la lentille L3, et ainsi de décaler la tâche dans le plan focal arrière de l’objectif, ce qui augmente l’angle d’incidence à l’interface lamelle-échantillon. Ainsi en tournant ce miroir et en augmentant l’angle, on va pouvoir passer d’une excitation d’epifluorescence classique à une excitation en réflexion totale interne. Puis, une fois en configuration TIRF, on peut changer légèrement l’angle, et ainsi jouer sur la profondeur de pénétration du champ évanescent. Avec cette configuration, nous pouvons estimer l’angle incident du faisceau excitateur sur la lentille, et donc en déduire approximativement une profondeur de pénétration pour le champ évanescent. Mais nous n’avons pas accès précisément à cette grandeur.