Évaluation du statut en vitamine A et de ses déterminants

Évaluation du statut en vitamine A et de ses déterminants

MESURES

Prélèvement et conservation des échantillons de sang

Les échantillons de sang sont obtenus par ponction veineuse. Toutes les précautions d’asepsie ont été prises et rigoureusement contrôlées. Dans un tube en polyéthylène de 5 ml à usage unique, indemne de contamination métallique et contenant un anticoagulant (héparine de lithium) (Réf. n° 01.1604.400 ; Sarstedt AG et Co, Numbrecht, Germany), un échantillon de sang a été prélevé auprès de chaque enfant à l’abri de la poussière et protégé de la lumière avec du papier aluminium. Les échantillons sont ensuite transportés dans une glacière à 4°C puis traités dans la « voiture laboratoire » munie d’une chaîne de froid. Le sang total résiduel (une partie ayant servi à la détermination du taux d’hémoglobine) est aussitôt centrifugé à 760 g (3200 tours/min) pendant 12 min (EBA20, model 2002, Andreas, Hettich Gmbh & Co-KG, Tuttlingen, Germany) pour obtenir le plasma. Ce dernier est réparti dans 3 cryotubes de 2 ml (Cryovials Nalgène ; Nunc International, New York, USA) qui sont conservés à -20°C dans le congélateur de la voiture, puis stockés plus tard à -80°C au laboratoire de nutrition jusqu’aux dosages.

Dosage du rétinol plasmatique

La chromatographie liquide de haute performance (HPLC) est la méthode utilisée pour la mesure de l’indicateur biologique, la concentration plasmatique en rétinol. L’HPLC est considérée comme la seule technique de laboratoire fiable pour la mesure de la concentration plasmatique en rétinol d’une population (Sommer et Davidson, 2002). C’est une méthode 5 chimique de séparation des constituants d’un mélange en fonction de leur affinité avec d’autres molécules.  Appareillage L’appareillage est une chaîne Spectra SYSTEM qui comprend un dégazeur à membrane SCM1000, une pompe quaternaire à gradient P1000XR, un passeur avec injecteur automatique AS3000, un dé tecteur à barrettes d’iodes UV6000LP et un module d’interface SN 4000, l e tout piloté par ordinateur. L’ensemble du système est géré par le logiciel ChromQuest®, version 4.1 (Thermo Electron SAS, Cedex, France) qui traite les résultats.  Principe Le principe de la détermination se base sur le fait qu’après précipitation de ses protéines vectrices (le Retinol Binding Protein (RBP) et la Transthyrétine (TTR)) provoquée par l’addition d’éthanol, le rétinol est extrait par l’hexane et sa concentration est ensuite déterminée par chromatographie en phase inversée à l’aide d’une colonne Water ResolveTM (3,9 x 150 mm) C18, 5 µm, 90Å, protégée par une pré-colonne (3,9 x 20 mm) (Waters Corporation, Massachusetts, USA) couplée à une détection UV à 325 nm.  Mode opératoire Le rétinol est dosé dans 200 μL de plasma en présence de 40 µl d’un standard interne, l’acétate de rétinol. Ce mélange est agité au vortex pendant 30 s avant l’ajout de 200 µl d’une solution d’éthanol-BHT (butylhydroxytoluène, antioxydant) à 0,1%. Un volume de 500 µl d’hexane est ajouté au mélange, avant qu’il ne soit homogénéisé au vortex et centrifugé à 300 g, puis 450 µl du surnageant (phase organique) sont prélevés et transvasés dans un autre tube. Cette opération d’extraction par l’hexane est reprise pour s’assurer que toute la vitamine A de l’échantillon a été prélevée. Les extraits de vitamine A sont ensuite évaporés sous azote grâce à un é vaporateur N-EVAPTM112 (Organomation Associates, Berlin, USA). Le résidu sec obtenu est repris dans 80 µl d’une solution de Méthanol/Dichloroéthane (75/25) et 40 µl de ce mélange sont injectés dans le chromatographe. La phase mobile est constituée d’un mélange de Méthanol/Eau (95/5) réglé à un débit de 1 ml/min. La lecture est faite à u ne longueur d’onde de 325 nm. 6  Détermination de la concentration plasmatique en rétinol L’aire du pic de rétinol est utilisée pour le calcul de la concentration de rétinol à l’aide de l’équation de la courbe d’étalonnage externe. Un volume de 20 µl d’acétate de rétinol (standard interne) est injecté seul pour évaluer le rendement de l’extraction de rétinol purifié. Ce rendement est le rapport des surfaces des pics d’acétate de rétinol de l’échantillon et du standard interne. Les concentrations obtenues sont ensuite corrigées par le rendement d’extraction qui doit être supérieur à 90%.  Contrôle de qualité La qualité des mesures a été effectuée à l’aide d’un pool de plasma interne préparé au laboratoire.  Définition de la carence en vitamine A La carence sévère en vitamine A est définie par une concentration plasmatique en rétinol (RP) ≤ 0,35 μmol/L et la carence marginale, par une rétinolémie comprise entre 0,35 et 0,70 µmol/L (0,35 < RP ≤ 0,70 µmol/L) (WHO, 1996). 4.3. Dosages de l’alpha-1 acide glycoprotéine (AGP) et de la protéine Créactive (CRP) Le dosage de la protéine C-Réactive (CRP) et de l’alpha-1 Acide Glycoprotéine (AGP), protéines de la phase inflammatoire aiguë et chronique respectivement, a été effectué par immuno-turbidimétrie à l’aide de l’analyseur automatique A15 (BioSystems S.A, Barcelona, Spain) piloté par un ordinateur.  Appareillage et réactifs L’analyseur A15 se compose de trois éléments principaux : o Le bras manipulateur o Le système de dosage : ce système se compose d’une pointe thermostatée, d’un plateau avec 4 po sitions libres pour des portoirs de réactifs et d’échantillons, un conteneur de déchets, un conteneur de liquide système et un a utre contenant une solution de lavage. 7 o Le rotor de réactions et de lecture : où se font les mélanges réactionnels et la lecture directe de l’absorbance. La protéine C-réactive est dosée par un ki t (Réf 13921, BioSystems, Barcelona, Spain) contenant les réactifs A (un tampon de glycine à 0,1 mol/L, pH 8,6 ; 2 x 16 ml) et B (suspension de particules de latex sensibilisées avec les anticorps anti CRP humaine ; 2 x 4 ml) et un standard (1 x 1 ml) reconstitué avec de l’eau distillée. L’AGP est dosé avec un Tampon Tris (50 mmol/L, pH 8,5) (Réf 31928, BioSystems, Barcelona, Spain) contenant des anticorps de chèvre anti-AGP humaine et quantifié à l’aide d’un standard (1 x 1 ml ; Réf. 31195) qui est utilisé pour la courbe de calibration.  Dosage de la Protéine C-Réactive (CRP) o Principe du dosage de la Protéine C-Réactive (CRP) La protéine C-réactive (CRP) plasmatique provoque une agglutination des particules de latex couvertes avec les anticorps anti-protéine C-réactive humaine. L’agglutination des particules de latex est proportionnelle à l a concentration en CRP et est quantifiée par turbidimétrie. o Mode opératoire Cents microlitres (100 µl) de plasma (ou les solutions contrôles, ou le standard) sont introduits dans une cuve placée sur le plateau des échantillons de l’appareil ; et les réactifs et solutions (solution saline, eau pure, réactifs de CRP (mélange réactifs A et B)) sont disposés sur le plateau réservé aux réactifs. Au cours du dos age, 440 µl de réactif de CRP et 3 μl d’échantillon de plasma sont aspirés par l’analyseur pour en faire un mélange. Celui-ci est distribué dans les cuvettes du rotor et l’absorbance est lue à 340 nm. o Définition de l’inflammation aigüe L’infection et/ou l’inflammation aiguë est définie par des concentrations plasmatiques en CRP≥ 5 mg/L et en AGP < 1g/L. 8  Dosage de l’alpha-1 Acide Glycoprotéine (Orosomucoïde) o Principe du dosage de l’alpha-1 Acide Glycoprotéine (Orosomucoïde) Il repose sur le fait qu’en présence d’anticorps anti-alpha-1 glycoprotéine acide humaine, l’orosomucoïde présente dans l’échantillon précipite. La dispersion de lumière générée par les complexes antigènes-anticorps est proportionnelle à la concentration en alpha1 acide glycoprotéine et est quantifiée par turbidimétrie. o Mode opératoire Cent microlitres de l’échantillon (ou de sérum contrôle, ou du pool interne de plasma) sont introduits dans les cupules correspondantes et le réactif AGP, disposé sur le plateau des réactifs. Le mélange réactionnel est effectué avec 3 µl de plasma et 300 µl de réactif AGP qui sont introduits dans les cuvettes du rotor. Les signaux lumineux générés par les complexes antigène-anticorps, lors de la lecture à 340 nm, sont proportionnels à la concentration en AGP présente dans l’échantillon. L’absorbance obtenue est soustraite de l’absorbance du bl anc (solution saline à 0,9%) pour donner l’absorbance réelle de l’échantillon. Par interpolation avec la courbe de calibration, la concentration en AGP de l’échantillon est calculée selon la loi de Beer Lambert. Le dosage de l’AGP est effectué en double. La mesure est validée si le coefficient de variation est inférieur à 5%. o Définition des inflammations chronique et aiguë et chronique L’infection et/ou l’inflammation chronique est défini par des concentrations plasmatiques en en AGP ≥1g/L et en CRP < 5 mg/L. L’infection et/ou l’inflammation aiguë et chronique est définie par des concentrations plasmatiques en AGP et en CRP supérieures ou égales respectivement à 1g/L et 5mg/L  Contrôle de qualité La précision et la validité des mesures des concentrations en CRP et en AGP sont respectivement vérifiées grâce à des solutions de sérum contrôle (BioSystems S.A, Barcelona, Spain) de niveaux I (Réf. 31213) et II (Réf. 31214) et de niveaux bas (Réf. 31211) et haut (Réf. 31212) fournies dans le coffret. Un pool de plasma interne est également utilisé pour le contrôle de qualité interne.