Évaluation des activités biologiques

ÉVALUATION DES ACTIVITÉS BIOLOGIQUES

Chacun des extraits obtenus du criblage (20 extraits) a subi les tests d’activités biologiques suivants; anti-inflammatoire, antioxydants (cellulaire et ORAC), cytotoxicité cellulaire, antifongique et antibactérien.

Activité anti-inflammatoire

L’activité anti-inflammatoire évalue la réactivité des macrophages lorsqu’ils sont en présence de corps étrangers, de débris cellulaire ou pour ce test-ci, de lipopolysaccharides de paroi bactérienne d’E. coli (LPS). L’activité se mesure par la quantification de nitrite en solution à la fin du test. Lors de l’ajout des LPS aux macrophages dans le milieu de culture, ces derniers produisent du monoxyde d’azote (NO) par l’action d’une enzyme, la Nitric Oxide Synthase (forme inductible : iNOS), pour détruire le corps nuisible. Une fois dans le milieu de culture le NO est converti en nitrite et devient quantifiable par l’ajout du réactif de Griess en mesurant l’absorbance de la solution .

Les macrophages murins (RAW 264.7) qui sont en croissance exponentielle, sont déposés dans des microplaques de 96 puits (BD Falcon) à une densité de 7.5 X 10⁴ cellules par puits dans 100 µl de milieu nutritif (DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, vitamines 1X, pénicilline et streptomycine) et ils sont laissés en incubation pour une nuit. Par la suite, les cellules sont traitées avec ou sans contrôle positif, le N(ω)-nitro-1-arginine methyl ester (L-NAME), un inhibiteur connu de la iNOS, ou avec les solutions des extraits à l’analyse en concentrations croissantes dissoutes dans le diméthylsulfoxide (DMSO). La concentration finale de solvant dans le milieu nutritif est maintenue à 0,5 % (v/v) pour éviter que le solvant devienne toxique. Les cellules sont ensuite stimulées avec 100 µg/ml de LPS et sont incubées pendant 24 h à 37°C et avec 5 % de CO2. Après 24 h d’incubation, le surnageant sans cellule est récolté et le dosage de l’oxyde nitrique est déterminé en utilisant la réaction de Griess (Green et al. 1990), avec quelques modifications apportées. Brièvement, des aliquots de 100 µl de surnageant sont incubés avec 50 µl de 1 % sulphanilamide et 50 µl de 0,1 % N-1-naphtylethylenediamine dihydrochlorine dans 2,5 % H3PO4 à température  pièce pendant 20 minutes. L’absorbance est mesurée à 550 nm avec un lecteur de plaque automatique Varioskan (Thermo electron) et la quantité de nitrite est déterminée par comparaison avec une courbe standard de NaNO2 (Green et al. 1990).

Activités antifongiques et antibactériennes 

L’activité antibactérienne s’évalue sur deux souches de bactéries, une Gram positive, la Staphylococcus aureus et une Gram négative, l’Echerichia coli. La méthode utilisée est celle décrite par Banfi avec quelques modifications (Banfi et al. 2003). Les bactéries, dont la croissance est exponentielle, sont ensemencées dans des plaques à 96 puits avec une densité précise dans 50 µl de milieu nutritif (DMEM). La densité pour E. coli est de 5 X 10³ pour chacun des puits et de 45 X 10³ par puits pour S. aureus. Des solutions des extraits à tester sont préparées dans le MeOH à des concentrations croissantes et sont ensuite ajoutées aux puits. Pour éviter la toxicité cellulaire, le pourcentage de solvant est toujours inférieur à 0,5 %. Par la suite, la microplaque est incubée à 37°C pour une période de 24 heures d’exposition. Après le temps d’exposition, l’absorbance est mesurée avec un lecteur de plaque Varioskan, la longueur d’onde utilisée pour mesurer l’absorbance est de 600 nm. Si une concentration testée résulte en une inhibition de 80% de la croissance bactérienne, celle-ci est rapportée comme étant la CMI80 (concentration minimale inhibitrice). L’activité antifongique est évaluée par la même méthode à l’exception de la souche, du témoin et la mesure de l’absorbance se fait à 540 nm. La souche pour l’activité antifongique est la levure Candida albicans et le témoin positif est l’amphotericin B. Le témoin positif pour l’activité antibactérienne est la Chloramphénicol.

Activités antioxydantes cellulaires et ORAC 

L’activité antioxydante sur cellules est évaluée à l’aide de la 2’,7’ dichlorofluorescindiacetate (DCFH-DA) selon la méthode de Girard et Lalancette avec quelques modifications (Girard-Lalancette et al. 2009). L’évaluation débute avec l’ensemencement de plaques à 96 puits avec 10 000 cellules de type fibroblastes humain non cancéreux (WS1) dans chacun des puits dans 100 µl de milieu nutritif (DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, vitamines 1X, pénicilline et streptomycine) qui sont par la suite incubées pendant 24 heures à 37°C et l’incubation se fait en présence de CO2 à 5 %. Ensuite, les cellules sont lavées avec une solution isotonique de HBSS (Hank’s balanced salt solution) à un pH de 7,4 puis incubées de nouveau pendant une heure avec 100 µl de HBSS contenant 5µM de DCFH-DA qui est un fluorochrome permettant de détecter l’oxydation intracellulaire. Les cellules sont à nouveau lavées avec 150 µl de HBSS. Pour évaluer l’activité antioxydante, les cellules sont incubées avec des solutions des extraits de concentrations croissantes en présence ou en absence de tert buthylhydroperoxyde (tBH). La fluorescence est mesurée après 1h et 4h avec le lecteur de plaques Fluoroskan Ascent FLtm en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 538 nm. L’activité antioxydante est exprimée par la concentration de l’extrait qui inhibe à 50 % (IC50) l’oxydation du DCFH lorsqu’il est comparé au contrôle, non traité avec les extraits, mais avec du T-BuOOH comme stress oxydatif, après la soustraction du blanc. Le témoin positif pour cette expérience est le Trolox ou la quercetine.

La méthode pour effectuer les tests ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) est issue des travaux de Ou (Ou et al. 2001) avec quelques adaptations. Ce test permet de connaitre la capacité d’une molécule ou d’un extrait à inhiber l’oxydation d’une sonde fluorescente, dans ce cas-ci, la fluorescéine. Une fois oxydée la fluorescéine n’est plus fluorescente. Les tests sont faits à 37°C et à un pH 7,4 avec le lecteur de plaques Fluoroskan Accent FLTM. Le contrôle positif pour le test ORAC est le Trolox. Des mesures de fluorescences sont prises toutes les 60 secondes pendant une heure suite à l’ajout de l’oxydant, le 2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH). Les résultats sont calculés par la comparaison des aires sous la courbe des courbes de diminution de la fluorescence entre le blanc et les extraits testés. Les résultats sont exprimés en micromoles d’équivalent Trolox (TE) par milligramme d’échantillon (µmol TE/mg).

Activité cytotoxique

Des cellules en croissance exponentielle ont été déposées dans des microplaques à 96 puits à une densité de 5×10³ cellules par puits dans un volume de 100 μl de milieu de culture (DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, vitamines 1X, pénicilline et streptomycine) et elles ont reposées pendant 16 heures pour leur permettre d’adhérer aux puits avant le traitement. Un gradient de concentration de chaque échantillon à analyser a été préparé dans du DMSO (Sigma-Aldrich) pour ensuite être dilué dans du DMEM avant d’être ajouté aux microplaques (100 μl par puits). Les cellules ont ensuite été incubées pendant 48 heures. Pour éviter la toxicité due au solvant, la concentration finale de DMSO dans le milieu de culture a été maintenue à 0,5% (v/v). La cytotoxicité fut évaluée à l’aide de la resazurine sur un lecteur automatisé de plaque Fluoroskan Ascent FLTM (Labsystems) en utilisant des longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 530 et 590 nm, respectivement. La fluorescence était proportionnelle à l’activité métabolique cellulaire dans chaque puits. Le pourcentage de survie a été défini comme la fluorescence dans les puits expérimentaux par rapport à celle des puits de contrôle après la soustraction des blancs (O’Brien et al. 2000).