Cours Gratuit
Evaluation de la réponse plasmatique en β-carotène suite à une consommation quotidienne de patate douce
Collecte des données et dosages biochimiques
Données socioéconomiques et alimentaires Un questionnaire ménage est soumis aux mères avant le démarrage de l’intervention pour collecter les données d’identification et les informations sanitaires. Un rappel de 24 heures est effectué une fois par semaine à partir du démarrage, pour évaluer les apports alimentaires moyens en β-carotène et en vitamine A provenant de la consommation familiale. La diversité alimentaire minimale (DAM) chez les enfants est définie par la proportion d’enfants ayant consommé, au moins quatre des sept groupes d’aliments définis pour les enfants de 6-23 mois, le jour précédent : (1) aliments de base (céréales, racines et tubercules), (2) légumineuses et noix, (3) produits laitiers, (4) produits carnés (viande, volaille et foie/organes) et poissons, (5) œufs, (6) fruits et légumes riches en vitamine A, et (7) autres fruits et légumes. II.7.2. Mesures anthropométriques Les enfants sont pesés nus ou en tenue légère, seuls ou par la méthode de la double pesée en utilisant une balance pèse-personne (Seca 877, GmbH et Co, Hamburg, Germany) de portée maximale 150 kg et de précision 100 g. La balance est posée sur une surface dure et plane. Elle est toujours calibrée avant son utilisation avec un poids étalon de 5 kg. Toutes les mesures sont faites en double. La taille (longueur) des enfants exprimée en cm est mesurée avec une toise horizontale UNICEF 10 (SECA 216, GmbH & Co, Hamburg, Germany) posée sur une surface plane, avec les mêmes précautions. Les enfants sont allongés sur le dos, la tête contre la partie fixe de la toise, le regard tourné vers le haut, les épaules, les fesses et les jambes touchent la planche de la toise, la colonne vertébrale non arquée, les deux bras positionnés le long du corps, la plante des pieds contre la planche et les orteils tournés vers le haut. Les mesures anthropométriques sont utilisées pour déterminer l’état nutritionnel des enfants à l’aide des indices Poids-pour-Taille z-score (PTZ) et Taille-pour-Age z-score (TAZ) avec les courbes standard définies par l’OMS (WHO, 2006). II.7.3. Dosage du β carotène dans la PDCO Les teneurs en caroténoïdes de la patate crue et bouillie ont été mesurées par colorimétrie (Schweigert et al., 2010) à l’aide d’un dispositif i-Check (iCheckTM carotene BioAnalyt GmbH, Allemagne). Les β-carotènes représentent 90% de la teneur en caroténoïdes totaux obtenue et sont donc calculés à partir de cette dernière (Rodriguez-Amaya & Kimura, 2004 ; Bengtsson et al., 2008).
Analyses biologiques
Prélèvement sanguin
Les prélèvements sanguins sont faits tôt le matin à jeun, par ponction veineuse à l’aide d’un dispositif constitué d’une aiguille (seringue) montée sur un tube de prélèvement sous vide en polyéthylène à usage unique, contenant de l’héparine de lithium comme anticoagulant (Sarstedt AG1&Co, Numbrecht, Germany). Le matériel de prélèvement est stérile, individuel et à usage unique. Un tube de 5 ml de sang est prélevé sur chaque enfant, et immédiatement recouvert de papier aluminium pour le protéger de la lumière. Les tubes sont ensuite conservés dans une glacière à 4°C. A la fin du prélèvement (environ 2h après), le sang est centrifugé à 767g (3200 trs/mn) à l’aide d’une centrifugeuse EBA 20 (model 2002, Andreas Hettich GmbH & Co.KG ; Tuttlingen, Germany) pendant 12 mn pour obtenir du plasma. Ce dernier est immédiatement réparti en aliquotes dans des Cryotubes stériles de 2 ml (Cryovials Nalgène, Nunc International, New York, USA), protégés avec du papier aluminium. Les cryobox contenant les tubes sont recouverts de papier aluminium et identifiés puis transportés à l’aide de glacières réfrigérées (Waeco International GmbH, Emsdetten, Germany) sur le site de recherche de l’équipe et conservés à -20°C jusqu’au retour au laboratoire. De retour au laboratoire de Nutrition (LARNAH) les échantillons sont placés à -80°C jusqu’au dosage.
Dosage de l’hémoglobine
Le dosage du taux d’hémoglobine effectué par ponction capillaire de la pulpe du doigt, avec le système HemoCue® (HemoCue 301+, AB, Angelholm, Sweden) fonctionnant selon le principe de la photométrie. Ce système comporte une micro cuvette contenant un réactif sec (désoxycholate de sodium, nitrite de sodium, azide de sodium et fluorescéine) qui au contact de la goutte de sang entraîne l’hémolyse des érythrocytes, ce qui libère l’hémoglobine. La lecture du taux d’hémoglobine se fait en 15-45 secondes. Les mesures sont effectuées en double et le seuil de non anémie chez les enfants de 6 à 59 mois est défini pour des taux d’hémoglobine supérieurs ou égaux à 11 g/dl, l’anémie est définie comme légère si 10 g/dl ≤ Hb ≤ 10,9 g/dl, modérée si 7 g/dl ≤ Hb ≤ 9,9 g/dl, et sévère si Hb < 7 g/dl.
Dosage du rétinol plasmatique
La mesure du rétinol plasmatique est faite par Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC). Le rétinol plasmatique permet de déceler des carences profondes ou des hypervitaminoses importantes (présence de palmitate de rétinol). Le principe de la détermination se base sur le fait qu’après précipitation de ses protéines vectrices (Retinol Binding Protein et Transthyrétine) provoquée par l’addition d’éthanol, le rétinol est extrait par l’hexane ; ce qui permet par la suite, après évaporation de l’hexane, de déterminer sa concentration par chromatographie liquide en phase inverse. La méthode consiste à additionner dans un tube en verre borosilicaté deux cents microlitres de plasma (200 μl) avec 40 μl d’acétate de rétinol (standard interne) qui sont ensuite traités avec 200 μl d’éthanol à 0,1% de BHT (butylhydroxytoluène, antioxydant). Après agitation au vortex, le mélange est extrait avec 2 x 500 μl d’hexane. Le surnageant d’hexane est prélevé et mélangé dans un second tube puis évaporé sous azote grâce à un évaporateur N-EVAP 112 (Organomation Associates, Berlin, USA). L’extrait sec de rétinol est repris dans 80 μl de méthanol/dichloroéthane (75/25, v/v) pour dissoudre la phase lipidique et un volume de 40 μl de cet échantillon est injecté dans le chromatographe. Un volume de 20 μl d’acétate de rétinol (standard interne) est injecté seul pour évaluer le rendement de l’extraction. Les concentrations en rétinol sont déterminées à l’aide de l’équation de la droite d’une courbe de calibration externe qui est réalisée à partir d’une solution de rétinol purifiée par HPLC. Les concentrations obtenues sont ensuite corrigées par le rendement d’extraction qui doit être supérieur à 90%. L’appareillage utilisé est une chaîne Spectra SYSTEM qui comprend une pompe quaternaire à gradient P4000 un passeur avec injecteur automatique AS3000, un détecteur à barrettes d’iodes 12 UV8000LP et un module d’interface SN 4000, le tout piloté par ordinateur. L’ensemble du système est géré par le logiciel ChromQuest, version 5.0 (Thermo Electron SAS, Cedex, France) qui traite les résultats. Tous les solvants utilisés sont de grade HPLC et la phase mobile est composée d’un mélange Méthanol/Eau (95/5, v/v) additionné de 0,05% de Triéthylamine (TEA) (dont le rôle est d’augmenter la résolution des pics) à un débit de 1 ml/min. La détection se fait par UV à 325 nm après migration sur une colonne Waters Resolve TM C18 (3,9×150 mm) 5µm, 90Å, protégée par une pré-colonne (3,9x20mm) (Waters Corporation, Massachusetts, USA) pendant 10 minutes.
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