Études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse

Études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse

L’aminopeptidase A cérébrale, une cible thérapeutirue potentielle dans le traitement de l’hypertension Chapitre 1 : L’aminopeptidase A, une aminopeptidase mono zinc membranaire Une aminopeptidase est une enzyme qui hydrolyse un ou plusieurs résidus situés en position N-terminale des peptides ou des protéines. Selon le nombre de résidus hydrolysés elle est dénommée aminopeptidase (1 résidu), dipeptidyl- aminopeptidase (2 résidus) ou tripeptidyl- aminopeptidase (3 résidus). Les peptidases monozincssont caractérisées par la présence,au sein de leurs iteactif,d’un motif de résidus contenantunglutamate;GluͿpermettantla liaisond’unatomedezinc.Ce Gluet l’atome de zinc jouent un rôle clé dans l’acte catalytiruedecettefamille d’enzymes (Figure 1). I) Introduction : Les peptidases monozincs Le clonage de nombreuses métallopeptidases zinc comme la thermolysine (Titani et al., 1972), l’aminopeptidaseN(Bally et al., 1984), la stromélysine (Whitham et al., 1986) ouencorel’endopeptidase neutre (Isobe and Okuyama, 1985; Devault et al., 1987) ont mis en évidence la présence de séquences consensus ces enzymes permettantd’établirlespremiğresclassificationsdecettefamilledeprotéines.La découverte de la structure cristallographique de plusieurs peptidases ont montré des homologies structuralesentrecesenzymesetpermisd’affinerlaclassification(Matthews et al., 1972, Matthews et al., 1974; Holmes et al., 1981; Jongeneel et al., 1989; Vallee et al., 1990; Rawlings et al., 1993; Bode et al., 1993; Gomis-Rüth et al., 1993; Baumann, 1994; Blundell, 1994; Rawlings et al., 1995). l’analyse desalignementsdeséruencesprotéiruesetdesstructurestridimensionnellesdecesenzymesa permis d’identifier différents motifs de liaison du zinc ainsi que des acides aminés liant également le zinc et situés une distance spécifique des motifs. Il a été établi une classification des peptidases mono zincs (Hooper, 1994) regroupant 4 grandes familles différenciées par leur motif de liaison du zinc, séparées en sous-famillesselonlanaturedel’acideaminéϯème ligand du zinc et de sa distance par rapport au motif de liaisons : – Les « zinzins » possédant dans leur séquence en acide aminés le motif de liaison du zinc HEXXH. – Les « inverzincins » dont le motif de liaison du zinc est HEXXEH. – Les « carboxypeptidases » dont le motif de liaison du zinc est HXE. – Les « DD- carboxypeptidases » dont le motif de liaison du zinc est HXH. 16 Figure 1 : Classification des peptidases adaptée Hooper et coll. (Hooper, 1994). Les résidus représentés en caractères gras et soulignés constituent les ligands du zinc. «X aa» représente la distance en acides aminés entre le premier ligand du zinc situé dans un motif consensus et le troisième ligand du zinc. 17 II) La famille des zinzins Cette famille est caractérisée par le motif de liaison du zinc HEXXH. Elle est divisée en 4 sous-groupes que sont : les gluzincins, les metzincins, les aspizincins et la peptide deformylase.

Les gluzincins

Le troisième ligand du zinc des gluzincins est un Glu situé en aval du motif HEXXH. La distance variable séparant ce Glu du motif HEXXH a permis de diviser les gluzincins en 4 sous-familles que sont : La sous famille de la thermolysine, celle de l’endopeptidase neutre, celle de l’enzyme de conversion de l’angiotensine celle des aminopeptidases.

La sous-famille de la thermolysine

La thermolysine (TLN, EC 3.4.24.27) (Matthews et al., 1972b), la pseudo lysine (EC 3.4.24.26, Pseudomonas Elastase) (McKay et al., 1992), la bacillomycine (EC 3.4.24.28) (Frigerio et al., 1997) et d’autres metallopeptidases de cette famille possèdent deux régions fortement conservées impliquées danslaliaisondel’atomedezinc.l’atomedezincdelathermolysine,parexemple,esttétracoordiné par les deux histidines (His) du motif HEXXH (His-2 et His-ϭϰϲͿ,par une molécule d’eau ainsi que par un Glu (Glu-166), situé dans le motif GXXNEXXSD, 20 acides aminés en aval du motif HEXXH. Au sein de ce motif, un aspartate (Asp-ϭϳϬͿpermetlastabilisationdel’His-2 (Colman et al., 1972; Matthews et al., 1972b, 1972a; Christianson and Alexander, 1990). Ainsi appartient cette famille, toute peptidase mono zinc présentant un motif HEXXH et un motif GXNXVS dont le Glu est situé environ 22 acides aminés en aval du motif HEXXH. d’unpointdevuestructural,toutescesenzymesprésententdeuxdomaines,un-terminal constitué d’hélices-α et de feuillets-β et un domaine C-terminal composé de 5 hélices-α. Domaines N et C Terminaux forment une interface où se situe le site actif.

La sous-famille de l’endopeptidase neutre

Cette sous-famille regroupe des enzymes comme l’endopeptidase neutre;ECϯ.ϰ.Ϯϰ.ϭϭͿ(Oefner et al., 2000) oul’endothéline;ECϯ.ϰ.Ϯϰ.ϳϭͿ(Schulz et al., 2009). Le Glu, troisième ligand du zinc, se trouve environ 64 acides aminés enavaldumotifHEXXH au sein de la séruenceconsensus ENXáDXGG .l’ásp de ce motifesté galement implirué dansl’actecatalytirueviaunrelais dechargea vecune des Hisdu motif HEXXH (Le Moual et al., 1991, 1994; Shimada et al., 1996) d’un point de vue structural, ces enzymes présentent deux domaines, un N-terminal constitué d’hélices-α, un C-terminal constitué d’hélices-α et d’un feuillet-β. l’interface formée par ces deux domaines contient le site actif.

La sous-famille de l’enzyme de conversion de l’angiotensine

l’enzyme de conversion del’angiotensine ;ECá,EC ϯ.ϰ.ϭϱ.ϭͿ(Kim et al., 2003; Natesh et al., 2003; Watermeyer et al., 2006) comme l’enzyme de conversion de l’angiotensine de type Ϯ ;ECáϮ, EC 3.4.17.23) (Donoghue et al., 2000; Towler et al., 2004) ainsirued’autresenzymesdecette famille, présentent un Glu, troisième ligand du zinc, environ 29 acides aminés en aval du motif HEXXH au sein de la séquence consensus GFHE á XG Doù se trouve également l’ásp coordinant la premiğre His du motif HEXXH (Williams et al., 1994). d’unpointdevuestructural,lesenzymesdecettefamilleprésententdeuxdomaines,un-terminal constitué d’hélices-α et de ϯ feuillets-β, un C-terminal constitué d’hélices-α et de Ϯ feuillets-β. l’interfaceforméeparcesdeuxdomainescontientlesiteactif.

La sous-famille des aminopeptidases

Cette sous-famille regroupe un iruementle samino peptidasesne possédantru͛ un seul atome d ezinc parmonomğred’enzymes.C͛estlecasdelaleukotriğneáϰ-hydrolase (EC 3.3.2.6) (Thunnissen et al., 2001),l’aminopeptidaseá;áPá,ECϯ.ϰ.ϭϭ.ϳͿ(Yang et al., 20) ou encore l’aminopeptidaseN;áPN, EC 3.4..2) (Wong et al., 20), l’aminopeptidase B ;áPB, EC ϯ.ϰ.ϭϭ.ϲͿ (Foulon et al., 1999). Le troisième ligand du zinc se trouve dans la séquence consensus LWLNEG (Medina et al., 1991; Vazeux et al., 1996) environ 24 acides aminés en aval du motif HEXXH. l’organisation structurale de cette sous-famille d’enzyme sera détaillée ci-après mais de façon résumée, cette famille de protéines présente deux domaines, un N-terminal constitué d’hélices-αet feuillets-β,unC-terminal constitué principalement d’hélices-α.Lăencore,l’interfacecontient le site actif. e) La sous-famille de la Thimet oligopeptidase Cette sous-famille contient des enzymes comme la Thimet oligopeptidase (EC 3.4.24.15) (Ray et al., 2004) ou la neurolysine (EC 3.4.24.16) (Brown et al., 2001). Le Glu 3ème ligand du zinc se trouve au centre du motif DXVEXPSXXXE et se situe environ 29 résidus en aval du motif HEXXH d’unpointdevuestructural,lesenzymesdecettefamilleprésententdeuxdomainesaveclesiteactif ă l’interface. Un domaine N-terminal constitué d’hélices-α et d’un petit feuillet-β, un C-terminal constitué d’hélices-α et d’un important feuillet-β.

Table des matières

Liste des abréviations
Partie 1 : l’aminopeptidase cérébrale,une cible thérapeutirue potentielledansle traitement de
l’hypertension
Chapitre 1 :,une aminopeptidase mono zinc membranaire

I) Introduction : Les peptidases mono zincs
II) La famille des zinzins

1) Les gluzincins

a) La sous-famille de la thermolysine
b) La sous-famille l’endopeptidase neutre
c) La sous-familledel’enzymedeconversiondel’angiotensine
d) La sous-famille des aminopeptidases
e) La sous-famille de la Thimet oligopeptidase

2) Les metzincins
3) Les asp zinzins
4) La peptide deformylase
III) La famille des inverzincins

IV) La famille des carboxypeptidases
V) La famille des DD-carboxypeptidase

Chapitre 2 :l’aminopeptidaseá

I) Historique .
II) Clonage et structure du gène

III) Organisationstructuraledel’áPá
1) Structure générale

a) Propriétés physiques
b) Rôle du domaine C-terminal

2) Spécificité de substrat

a) Substrats naturels
b) Substrats synthétiques

3) Les effets des ions métalliques
4) Inhibiteursdel’aminopeptidaseá

a) Les Inhibiteurs Aminopeptidases Mono Zinc
b) Lesinhibiteurssynthétiruesdel’aminopeptidaseá
IV) Expressiontissulaireetcellulairedel’áPá

1) A la périphérie
2) Au niveau central
Chapitre 3 : Le système rénine-angiotensine cérébral

I) l’angiotensinogğne
II) l’angiotensineϭ-

III) La rénine et d’angiotensine I

IV) l’enzyme de conversion de l’angiotensine
V) l’aminopeptidaseáetl’angiotensineIII
VI) l’aminopeptidase N l’angiotensine II

VII) Les voies angiotensine giques
VIII) Les récepteurs des angiotensines II, III et IV
Chapitre 4 :l’aminopeptidase á cible thérapeutique potentielle

I) Recherche du peptide effecteur du SRA cérébral

1)régulation de l’activité aminopeptidase dans lecerveau demodğles expérimentaux d’hypertension
b) Le rat DOCA-Sel, un modèle provoqué
2) l’angiotensine II : peptide effecteur du système rénine-angiotensine cérébral

a) Identificationdesvoiesmétaboliruesdel’ángIIetdel’ángIIIcérébrales
b) Rôles respectifs des Ang II et Ang III cérébrales dans le contrôle cérébral de la pression artérielle

II) Développementd’uneprodroguedel’ECϯϯactifparvoieorale

1) Le RB150
2) Mode d’action du ‘BϭϱϬ
3) Normalisation de la pression artérielle chez le rat hypertendu, preuve du concept du RB
III) Etudes cliniques du RB150/QGC001
Chapitre: Développer De Nouveaux Inhibiteurs de l’aminopeptidase á par de nouvelles études structure-fonction

I) Introduction
II) Etudes structurales sur des aminopeptidases mono zincs

1) l’aminopeptidase

a) Généralités
b) Modélisation de l’APB
c) Etudes structure-fonction

2) l’aminopeptidase N

a) Généralités
b) Structure cristallographique et études structure-fonction

3) l’aminopeptidase

a) La structurecristallographiquedel’aminopeptidaseáhumaine
b) Etudes structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagenèse dirigée

III) Objectifs de thèse

IV) Etudes structure-fonction sur les interactions de l’aPa.

1) Article :Etudedurôledel’arginineϴϳϴdel’áPádesourisdanslaspécificitédesubstratde
l’enzyme

a) Introduction
b) Discussion

2) Article 2 : Etude du rôle potentiel des résidus Arg-360 et Arg-378

a) Introduction

b) Discussion

Conclusions et perspectives
Partie 2 :Le récepteur de l’apéline,cible thérapeutique potentielle dans traitement de l’insuffisance
cardiaque et des désordres hydriques
Chapitre 1 :Le Récepteur De L’apéline,un récepteur couplé aux protéines G

I) Structure et classification
II) Moded’actiondes‘CPGs

1) Les ligands

a) Les ligands orthoptériques :Notions D’agoniste D’antagonisme
b) Les ligands allostériques
c) Les ligands biaisés

2) Les protéines G hétérotrimériques

a) La sous-unitéGα.
b) La sous-unitéGβɶ

3) La β-arrestine et l’internalisation desCPGs
Chapitre 2 :l’apéline son récepteur

I) Découverteetdésorphanisationdurécepteurdel’apéline

1) Clonage Structure Du Récepteur De L’apéline
2) l’apéline : ligand endogène du récepteur APJ, découverte et caractéristiques 0

II) l’apéline son récepteur : propriétés pharmacologiques

1) Caractérisation De L’interaction Apeline/récepteur

a) áffinitédel’apélinepoursonrécepteur
b) Etudes structure-activitédel’apéline

2) « signalisation du récepteur de l’apéline

a) Couplage Du Récepteur De L’apéline
b) Modulation des concentrations de calcium intracellulaire par l’apéline
c) l’activation de kinases
d) l’internalisation du récepteur de l’apéline .
e) ‘recyclage du récepteur de l’apéline
f) l’hétérodimérisationdurécepteur

Chapitre 3 : le système cholinergique

I) Distribution de l’apéline et des song récepteur

1) Dans le cerveau
2) Dans le rein
3) Dans le cœur et le Sartres

II) l’équilibre hydrique

1) Effets centraux de l’apéline sur l’activité desneuronesă á VP,sur la sécrétion d’aVP et sur la diurèse 2
2) Effets de l’apéline et de l’áVP sur le maintien de l’équilibre hydrique au niveau du rein
3) ‘égulationopposéedel’apélineetdel’áVPlorsdeladéshydratation

a) Effets de la déshydratation chez le rat

b) Effets De La Déshydratation Chez L’homme

4) Effets de l’ąge sur la régulation croisée entre l’apéline et l’áVP
III) Rôle dans la fonction cardiaque
1) Effetsdel’apélinesurlesvaisseaux .
2) Effets sur la pression artérielle .
3) Effets sur la contractilité cardiaque
Chapitre 4 :Lerécepteurdel’apéline,ciblethérapeutiruepotentielle