ETUDE SEQUENTIELLE DE PEPTIDES PAR SPECTROMETRIE DE MASSE

ETUDE SEQUENTIELLE DE PEPTIDES PAR SPECTROMETRIE DE MASSE

GENERALITES

Parmi les méthodes classiques d’analyse séquentielle de peptides linéaires et de protéines, celle d’Edmann est la plus utilisée. Elle consiste à faire réagir en milieu basique l’isothiocyanate de phényle avec le peptide. Le produit formé après clivage en milieu acide est alors la phénylhydantoïne de l’acide aminé N-terminal qui est ainsi identifié par chromatographie. La fonction amine de l’acide aminé suivant étant régénérée, la réaction est répétée successivement pour chaque acide aminé du peptide et la séquence complète est ainsi déterminée. Le séquençage biochimique d’un peptide peut se faire également à partir de l’extrémité C-terminale par l’utilisation d’une carboxypeptidase qui libère l’un après l’autre l’acide aminé C-terminal, lequel est identifié. Les peptides cycliques et les peptides dont les extrémités C et N terminales sont bloquées ne peuvent pas être séquencés par ces méthodes. Les méthodes spectrométriques (spectrométrie de masse) sont alors des méthodes appropriées. En spectrométrie de masse, les ions formés par fragmentation d’un cyclopeptide sont nommés selon la nomenclature introduite par Roepstorff (1984) et Biemann (1988). On définit ainsi les ions bn et yn issus de la rupture de la liaison amide selon que la charge positive est conservée sur le fragment N-terminal (bn) ou C-terminal (yn). De même la rupture de la liaison entre Cα et CO conduit à la formation de la série d’ions an. La différence de masse entre deux ions consécutifs de la même série bn ou an correspond à la masse du résidu éliminé et permet ainsi de déterminer l’enchaînement des acides aminés, une limite est la difficulté de différencier deux isomères tels que Leu et Ile. Les autres types de fragments sont plus rarement observés.

SEQUENÇAGE DE PEPTIDES CYCLIQUES

L’observation des ions quasi-moléculaires [M+H]+ , [M+Na] + et [M+K]+ sous ionisation ESI (Electro Spray Ionisation) permet de déterminer la masse moléculaire. Par contre le séquençage des peptides cycliques par spectrométrie de masse en tandem MS/MS est très délicat en raison des multiples possibilités de rupture du peptide durant la collusion car la protonation se fait aléatoirement sur tous les azotes de la molécule.

Spectre de masse ESI-Q-TOF de intégerrimacyclopeptide

A La figure 13 représente le spectre ESI-Q-TOF de intégerrimacyclopeptide A montrant l’ion protoné [M+H]+ à 767 m/z et les ions adduits [M+Na]+ et [M+K]+ respectivement à 789 et 805 m/z. De ces données on peut déduire que intégerrimacyclopeptide A a une masse M de 766 et comme formule brute C37H66N8O9. Cette formule est en accord avec la composition en acides aminés et correspond à la présence de huit résidus d’acides aminés moins une molécule d’eau. Figure 13 : Spectre de masse ESI-Q-FOF-MS de intégerrimacyclopeptide 

Fragmentation de l’ion moléculaire [M+H]+

L’ion moléculaire [M+H]+ à 767 m/z a été sélectionné pour le spectre de fragmentation à 40 eV, en présence d’azote. Pour rendre plus aisé l’exploitation des résultats, les acides aminés ont été numérotés en exposant. Sur le spectre CID (Collusion Ionisation Diffusion) de intégerrimacyclopeptide A, la série d’ions acyliums de type bn1 correspondant à la rupture de liaison Ile4 -Ser3 indique la 21 perte successive d’une Ile (m/z 654), d’une Ile (m/z 541), d’une Leu (m/z 428), d’une Gly (m/z 371), d’une Ile (m/z 258), d’une Leu pour donner le dipeptide protoné Gly-Ser (m/z 145). Une seconde série d’ions est observée décalée de 28 uma. Elle est attribuée à la série d’ions de type an1 dont l’analyse permet de confirmer la perte successive des résidus cités. La même analyse a permis d’identifier les séries d’ions acyliums bn2, bn3, bn4…correspondant aux autres fragmentations du cyclopeptide, elle confirme la séquence attribuée à intégerrimacyclopeptide A : cyclo(Leu/Ile1 -Gly2 -Ser3 -Leu/Ile4 -Leu/Ile5 -Leu/Ile6 – Gly7 -Leu/Ile8 ) (Fig. 6 et 7).