Etude phytochimique et substances bioactives de la plante médicinale

Etude phytochimique et substances bioactives de
la plante médicinale

 Intérêts biologiques des radicaux libres dans la physiologie cellulaire

La phagocytose

Les radicaux libres jouent un rôle essentiel dans le bon déroulement de la réaction immunitaire. La phagocytose des bactéries et des parasites par les macrophages ou les polynucléaires s’accompagne d’une production d’espèces réactives de l’oxygène si brutale et intense qu’elle est connue sous le nom «Bouffée respiratoire » puisqu’elle s’accompagne d’une augmentation transitoire de la consommation d’oxygène. Au sein de phagosome, l’activation de la NADPH oxydase, l’action des superoxydes dismutases (SOD) et la NO synthase (NOS) aboutissent à un mélange très corrosif de O2 •- , H2O2, HO•, ONOOH. L’eau oxygénée (H2O2), en présence de chlore et sous l’effet de la myeloperoxydase, donnera naissance à l’acide hypochlorique HOCl, c’est l’oxydant microbicide le plus puissant [27]. 3/2 H2O2+Cl‾ HOCl‾ +H2O2

La signalisation cellulaire

En dehors de leurs actions délétères, les ERO peuvent agir en tant que molécules de signal et intervenir dans la communication intracellulaire et intercellulaire. Ils participent à l’expression de certains gènes et à leur régulation. Cela leur confère un rôle important dans les phénomènes de croissance et de mort cellulaire. Les mécanismes de communication cellulaire faisant intervenir les radicaux libres ne sont pas encore élucidés. En résumé : – Les radicaux libres joueraient un rôle dans la régulation de l’expression des gènes. La présence de radicaux libres dans le milieu extracellulaire est à l’origine de l’activation de certains facteurs de transcription par des mécanismes encore mal compris. Il en résulte ensuite l’expression des gènes correspondants [28]. – Les radicaux libres peuvent intervenir dans la prolifération, la différenciation, l’adhésion et la migration [29]. – Les radicaux libres participent au fonctionnement de certaines enzymes, à la transduction de signaux cellulaires [26]. Étude bibliographique Radicaux libres, stress oxydatif et antioxydants – Les radicaux libres jouent un rôle dans la régulation de la dilatation capillaire, au fonctionnement de certaines neurones et notamment celles de la mémoire [26]. II. Le stress oxydant : Les EOR et ERN sont connues pour jouer un double rôle dans les systèmes biologiques, puisqu’ils peuvent être à la fois nocifs mais aussi bénéfiques, voire indispensables pour les organismes vivants [30] : ➢ Bénéfiques, lorsqu’ils sont impliqués dans des rôles physiologiques au niveau des réponses cellulaires telles que la lutte contre des agents infectieux et leur fonction dans les systèmes de signalisation cellulaire, ➢ Nocifs, lorsqu’il y a un déséquilibre entre la balance des ERO et ERN et les systèmes de défense, avec comme conséquence l’apparition de dégâts souvent irréversibles pour la cellule (ADN, protéines, lipides) en lien avec l’apparition de nombreuses maladies graves (cancer, artériosclérose, arthrite, maladies neurodégénératives): c’est le stress oxydatif [31]. Figure 02: Déséquilibre Antioxydant /Oxydant [32]. III. Les antioxydants : Dans des conditions normales, le métabolisme aérobique chez les mammifères génère des substances réactives de l’oxygène, qui sont très dommageables pour les cellules de l’organisme. Cependant, en guise de protection, les cellules possèdent des mécanismes de défense endogènes enzymatiques et non-enzymatiques qui, de manière générale, suffisent à neutraliser et à dégrader les radicaux libres toxiques pour les tissus résultant du métabolisme aérobique et que l’on appelle antioxydant [33-36].

Étude bibliographique Radicaux libres, stress oxydatif et antioxydants 

Définition : Selon les références bibliographiques [37-39], un antioxydant est n’importe quelle substance, qui, lorsqu’elle est présente en concentrations faibles, comparées à celle du substrat oxydable, retarde ou prévient de façon significative ou empêche, l’oxydation de ce substrat. On appelle antioxydants primaires, les composés donneurs d’atome d’hydrogène conduisant à un radical libre stable, c’est-à-dire beaucoup moins réactif que les radicaux libres porteurs de chaînes. Ce sont le plus souvent des phénols encombrés ou des amines aromatiques secondaires. On les appelle aussi antioxydants par rupture de chaîne ou désactivateurs de radicaux libres. En présence d’un phénol Ph -OH, par exemple, on peut présenter le processus, comme suit [40] : RO2 ● + Ph-OH ROOH + Ph-O ● Comme on l’a vu auparavant, l’hydroxyle est le radical le plus réactif et le plus dangereux dans l’organisme. La neutralisation de produits des réactions radicalaires de HO• est considéré comme une réaction importante et serait à la base de l’effet des antioxydants contenus dans l’alimentation sur l’incidence de certaines maladies [41-42]. Les peroxydes sont des produits primaires de l’oxydation. Les décomposeurs de peroxydes (sans formation de produits radicalaires) désactivent ces derniers ; on les appelle parfois antioxydants secondaires parce qu’ils suppriment les peroxydes qui sont des amorceurs secondaires de l’oxydation. Ce sont, par exemple, des sulfites, des phosphates ou des thioesters 

Systèmes de défense

Afin d’empêcher la formation des radicaux libres et de limiter l’oxydation qui provoque les dommages oxydants dans les cellules, l’organisme est équipé de plusieurs systèmes de défense, à savoir : enzymatiques et non enzymatique (moléculaires naturels et synthétiques) (Figure 03). Étude bibliographique Radicaux libres, stress oxydatif et antioxydants  Figure 03 : les antioxydants enzymatiques et non enzymatiques [49].

Le Système antioxydant enzymatique

Les protéines enzymatiques antioxydantes constituent la première barrière de cette défense antioxydante, qui est constituée de trois métalloenzymes essentielles: les superoxydes dismutases, la catalase et les glutathions peroxydases. Leurs activités et leurs localisations dans la cellule sont complémentaires et assurent l’élimination des anions superoxydes et du peroxyde d’hydrogène dans tous les compartiments intracellulaires. Figure 04: Action de l’antioxydant au cours du métabolisme des dérivés réactifs de l’oxygène [50]. Étude bibliographique Radicaux libres, stress oxydatif et antioxydants

Les superoxydes dismutases

Les superoxydes dismutases ou SOD (EC 1.15.1.1) sont des antioxydants enzymatiques ubiquitaires. Ces métalloprotéines représentent l’une des premières lignes de défense contre le stress oxydant en assurant l’élimination de l’anion superoxyde par une réaction de dismutation en le transformant en peroxyde d’hydrogène et en oxygène moléculaire [51]. Ces enzymes accélèrent la vitesse de cette réaction spontanée rendant très rapide la disparition du superoxyde mais en générant le peroxyde d’hydrogène. Celui-ci est un composé oxydant diffusible et dangereux à distance [52] mais il peut être ultérieurement catabolisé par la catalase et les glutathion peroxydases. Chez l’homme, trois isoformes de l’enzyme SOD qui diffèrent par leur structure et leur localisation cellulaire ont été caractérisées de façon biochimique et moléculaire. La Cu/ZnSOD ou la SOD1 cytosolique, et la ECSOD ou la SOD3 extracellulaire, utilisent le cuivre et le zinc comme cofacteurs nécessaires à l’activité enzymatique, lorsque la SOD2, mitochondriale, utilise le manganèse 

Catalase

La catalase (EC1.11.1.6) est une enzyme responsable de la détoxification du peroxyde d’hydrogène produit dans la condition physiologique [54]. Elle est localisée principalement dans les peroxysomes, mais aussi dans les mitochondries et le cytoplasme [55]. La réaction catalysée par cette enzyme est une dismutation du peroxyde d’hydrogène : 2H2O2 2H2O + O2 La Catalase est formée de quatre sous-unités, chaque sous-unité comporte un groupement ferriprotoporphyrine dans son site actif avec un atome de Fer à l’état Fe 3+ et une molécule de NADPH. La fixation du NADPH par la catalase lui confère une protection contre l’attaque de l’H2O2 [39]. La catalase et la glutathion peroxydase ont des rôles protecteurs similaires et leur contribution relative est assez variable. La catalase est surtout active lorsque le niveau de stress oxydatif est élevé ou que la quantité de glutathion peroxydase est limité, elle joue un rôle significatif en permettant d’éliminer l’excès de peroxyde d’hydrogène afin que la réaction de Fenton ne puisse pas s’amplifier [57]. Étude bibliographique Radicaux libres, stress oxydatif et antioxydants 

Glutathions peroxydase (GPX)

Le glutathion peroxydase (EC 1.11.1.19) est un des enzymes tétramérique à sélénium qui peut réduire le peroxyde d’hydrogène en eau, en utilisant les capacités réductrices du couple. Glutathion /glutathion disulfide (GSH/GSSG) [57,58]. Figure 05 : Cycle oxydo-réducteur du glutathion [59]. Elles permettent également de limiter la propagation des réactions radicalaires en chaine, en réduisant les peroxydes instables en acide gras hydroxylés. Ce système ne fonctionne que si le GSSG formé est continuellement réduit en GSH, ce qui est assuré par la glutathion réductase en présence de NADPH, ce dernier pouvant être lui-même régénéré par l’intermédiaire d’un couplage métabolique avec la voie des pentoses phosphatés [60]. Chez les Eucaryotes, on distingue cinq isoenzymes de la GPx qui sont présentes dans les liquides extracellulaires et dans les cellules au niveau du cytosol et des mitochondries: La GPx 1 cytoplasmique et mitochondriale, la GPx2 gastro-intestinale, la GPx3 plasmique, la GPx 4 ou PHGPx localisée à l’interface de la membrane interne du cytoplasme et la GPx5 épididymaire. La plus abondante est la GPx 1 et elle est exprimée dans la plupart des cellules [28]. A l’activité de Séléno-dépendante, il faut ajouter les GSH-S-transférases, protéine sans sélénium. Ces enzymes constituent une classe formée d’un très grand nombre d’isoenzymes.  Les glutathions transférases possèdent aussi une activité peroxydasique vis-à-vis des peroxydes organiques mais pas vis-à-vis du peroxyde d’hydrogène

Le système antioxydant endogène non enzymatique

Ce groupe de systèmes antioxydants renferme de nombreuses substances endogènes parmi lesquelles on peut citer le glutathion, l’acide urique, la bilirubine, l’acide lipoïque et le coenzyme Q. 

Glutathion

Le GSH est un tripeptide (Lγglutamy-l-cystéinyl-glycine) impliqué dans de nombreux processus au niveau intracellulaire. Son rôle dans la détoxication de xénobiotique [62] et dans la protection des lipides, des protéines et des acides nucléiques contre l’oxydation a été bien établi [63]. Dans des conditions physiologiques, le glutathion sous forme réduite (GSH) représente la très grande majorité du glutathion total (90 à 98%). Lors d’un stress oxydant, le GSH est oxydé avec la formation de pont disulfure, GSSG, et/ou de pont disulfure mixte, GSSR (R étant fixé à un autre thiol radicalaire) [63]. Le glutathion agit également comme Co-substrat d’enzymes antioxydantes telles que la glutathion peroxydase, la glutathion réductase et la transférase [64]. Il fait aussi l’objet d’interactions synergiques avec d’autres composants du système de protection antioxydant telles que la vitamine C ou la vitamine E .

L’acide urique

Le tissu humain ne possède pas l’enzyme nécessaire à la dégradation de l’acide urique en allantoïne, c’est-à-dire en l’urate oxydase. En conséquence, l’acide urique s’accumule comme produit final de catabolisme des purines, et est présent en quantité importante dans le plasma humain avant d’être éliminé par voie rénale. La perte de cette enzyme au cours de l’évolution pourrait avoir des effets bénéfiques puisqu’il a été démontré que l’acide urique possédait des propriétés antioxydantes [66]. A un pH physiologique l’acide urique est majoritairement ionisé sous forme d’urate, un piégeur puissant de radicaux (•OH, ROO• , NOO•…) [51]. III.2.2.3. Bilirubine La bilirubine est un produit terminal de la dégradation de l’hème et résulte essentiellement du catabolisme de l’hémoglobine par les cellules réticuloendothéliales. Ce composé liposoluble est capable de piéger les radicaux peroxyle, l’oxygène singulet et le radical hydroxyle, protégeant ainsi l’albumine et les acides gras liés à l’albumine des attaques Étude bibliographique Radicaux libres, stress oxydatif et antioxydants radicalaires [67]. La bilirubine est oxydée par certaines espèces recyclées par la biliverdine réductase. 

Acide lipoïque

C’est un antioxydant puissant qui peut régénérer d’autres antioxydants, telles que les vitamines C et E [70]. Il est capable de piéger le HO• , ROO• , HOCl• et O2 [70], de chélate des métaux lourds, réduit la glycation et interviendrait dans la réparation de l’ADN. Il existe sous forme oxydée et sous forme réduite. Produit en petite quantité par le foie, il se trouve également dans certains aliments (la levure, la viande de bœuf, l’épinard, le brocoli…)

Coenzyme Q10

La coenzyme Q10 appelée ubiquinone en raison de son ubiquité dans les cellules, est un dérivé benzoquinolique avec une longue chaîne latérale isoprénique [51]. Elle est hautement soluble dans les lipides, et se retrouve dans la quasi-totalité de la membrane cellulaire, ainsi que les lipoprotéines [72]. La CoQ10 synthétisée par l’organisme à partir du mévalonate qui est également impliqués dans la formation du cholestérol [73]. Cet antioxydant se trouve aussi dans des aliments comme les noix, le foie, les sardines, des grains complets et certains légumes. L’action biochimique primaire de la CoQ10 est une coenzyme pour de nombreuses N enzymes dans la chaîne de transport d’électrons, une série d’oxydoréductions de réaction impliquée dans la respiration cellulaire, où la présence de la coenzyme Q dans la membrane mitochondriale interne est nécessaire pour la conversion de l’énergie provenant des glucides et des lipides dans la synthèse d’ATP [72]. La CoQ10 contribue également à prolonger l’effet antioxydant de la vitamine E. Tous les processus physiologiques qui exigent une dépense énergétique requièrent la CoQ10.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
Partie I Étude bibliographique
Chapitre I Radicaux libres, stress oxydatif et antioxydants
I. Radicaux libres
I.1. Paradoxe de l’oxygène
I.2. Les radicaux libres ou les espèces réactives oxygénées
I.2.1. La réactivité d’ERO
I.2.2 Principales sources d’espèces réactives de l’oxygène.
I.3. Intérêts biologiques des radicaux libres dans la physiologie cellulaire
I.3.1.La phagocytose
I.3.2.La signalisation cellulaire
II. Le stress oxydant
III. Les antioxydants
III.1. Définition
III.2. Systèmes de défense
III.2.1. Le Système antioxydant enzymatique
III.2.1.1-Les superoxydes dismutases
III.2.1.2. Catalase
III.2.1.3. Glutathions peroxydase (GPX)
III.2.2. Le système antioxydant endogène non enzymatique
III.2.2.1. Glutathion
III.2.2.2. L’acide urique
III.2.2.3. Bilirubine
III.2.2.4. Acide lipoïque
III.2.2.5. Coenzyme Q
III.2.3.Le système antioxydant exogène
III.2.3.1.Vitamine E
III.2.3.2.Vitamine C
III.2.3.3.β carotèn
III.2.3.4. Sélénium
III.2.3.5. Les composés phénoliques
a. Biosynthèse des polyphénols
a1. La voie de Shikimate
a2 . La voie de l’acétate malonate
B. Classification des polyphénols
b1. Les non flavonoïdes
b2 .Les flavonoïdes C6-C3-C6
b3. Les tanins
C. Propriétés biologiques et intérêt des polyphénols8
1.Chez les végétaux
2. Chez l’être humain
3. Activité antioxydante
a.Piégeage des radicaux libres
b.Chélation des ions métalliques
c.Inhibition enzymatique
4. Méthode de mesure de l’activité antioxydante
a.Capacité de piégeage du radical DPPH
b.Méthode de FRAP
c.Méthode d’ABTS
d.Activité réductrice sur le ferricyanure de potassium
e.Capacité de piégeage du radical anion superoxyde
f.Méthode de Trolox
5. Activité anti bactérienne
6. Activité anti inflammatoire
7. Activité anti tumorale
8. Activité anti cardiovasculaire
CHAPITRE 2 Présentation des plantes étudiées
I. La famille Tamaricaceae
I.1. Généralités
I.2. Caractères généraux de la famille Tamaricaceae
I.3. Position systématique
I.1. Classification classique des Tamaricacées selon Cronquist 1988
I.3.2.Classification des Tamaricaceae selon APG 2003
I.4 Utilisations traditionnelles des Tamaricaceae
I.5.Etude pharmacologique des Tamaricaceae
I.6. Etude phytochimique et principaux métabolites secondaires isolés à partir de la famille des Tamaricaceae
I.6.1. les flavonoïdes
I.6.2. Les coumarines
I.6.3.Les huiles essentielles
I.6.4.Divers
I.7.Etude du genre Tamarix L
I.7.1.Caractères généraux du genre Tamarix L
I.7.2 L’espèce Tamarix gallica L
I.7.2.1 Nom vernaculaire
I.7.2.2 Classification
I.7.3.3 Description botanique du Tamarix gallica
I.7.3. L’espèce Tamarix articulata L
I.7.3.1 Nom vernaculaire
I.7.3.2. Classification
I.7.3.3 Description botanique du Tamarix articulata L
Partie expérimentale
Chapitre I Matériels et Méthodes
I. MATERIELS
I.1. Matériel végétal
I.1.1. Choix des plantes
I.1.2. Identification botanique
I.1.3. Récolte de la plante
I.2.Réactifs chimiques et appareillage
I.3. Souches bactériennes
II. Méthodes
II.1. Objectifs et méthodologie
II.2. Préparation des extraits
II.2.1. Préparation du filtrat hydrométhanolique
II.2.2. Fractionnement de la phase aqueuse
II.2.3. Calcul de rendement
II.3. Méthodes de caractérisation quantitative des polyphénols
II.3.1. Dosage des polyphénols totaux
II.3.2. Dosage des flavonoïdes
II.3.3. Courbes d’étalonnages des dosages des PPT et FVT
II.3.3.1. Courbe d’étalonnage pour le dosage de polyphénols totaux (PPT)
II.3.3.2. Courbe d’étalonnage pour le dosage de flavonoïdes totaux (FVT)
II.3.4. Chromatographie liquide de haute performance (HPLC)
II.3.4.1. Appareillage
II.3.4.2. Analyse des composés phénoliques par HPLC
II.5. Evaluation de l’activité antioxydante
II.5.1. Pouvoir antioxydant total
II.5.2. Test DPPH
II.5.3. Pouvoir réducteur (FRAP, Ferric Reducing Antioxydant Power)
II.5.4. Test ABTS
II.4.5. Test de blanchiment de β-carotène couplé à l’auto-oxydation de l’acide linoléique
II.6. Evaluation de l’activité antibactérienne
II.6.1. Test de diffusion en milieu gélosé
II.6.2. Détermination de la CMI et de la CMB
II.7. Analyse statistique
Résultats et Discutions
I. Rendements des extraits bruts
II.Compositions phytochimiques
II.1. Teneurs en phénols totaux
II.2. Teneurs des flavonoïdes
II.3. Résultats des chromatogrammes d’étalons
II.4. Résultats des courbes d’étalonnages des polyphénoles standards
II. Chromatogrammes HPLC des extraits méthanoïques des plantes étudiées
III. Résultats de dosage des activités antioxydantes in vitro
III.1. Résultats de l’évaluation d’activité antioxydante total
III.2. Résultats de l’évaluation d’activité antioxydante DPPH
III.3. Pouvoir réducteur du fer (Test FRAP: Ferric Reducing Antioxydant Power)
III.4. Résultats d’inhibition de radical ABTS
III.5.Résultats de l’évaluation d’activité antioxydante de test β-carotène
VI. Evaluation de l’activité antibactérienne
VI. Activité antibactérienne des extraits bruts par la méthode des disques
VI.2. Détermination de la CMI et la CMB
CONCLUSION GENERALE

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