Etude et développement d’un dispositif d’excitation de la fluorescence

Dans ce second chapitre, nous nous intéressons au dispositif d’excitation de la fluorescence. La mesure de durée de vie de fluorescence dans le domaine temporel impose un certain nombre de contraintes à la source excitatrice. Nous commençons par rapporter ces différentes contraintes et les principaux systèmes utilisés pour réaliser les mesures de temps de vie dans le domaine temporel, puis nous présentons la solution que nous proposons d’étudier et de réaliser. Ensuite, nous nous intéressons aux différentes parties constitutives de l’architecture que nous développons : tout d’abord l’oscillateur laser solide impulsionnel émettant dans l’infrarouge et pompé par diode, puis les fibres optiques permettant d’élargir le spectre d’émission. Nous présentons pour chacune de ces parties quelques éléments théoriques, les montages réalisés et les résultats expérimentaux. Enfin, après une analyse critique des résultats obtenus, nous présentons et caractérisons la source commerciale utilisée au final sur le dispositif de microscopie, et nous expliquons les raisons de ce choix. La mesure de temps de vie de fluorescence dans le domaine temporel impose un certain nombre de contraintes au dispositif d’excitation. Tout d’abord, pour réaliser ce type de mesures, il faut exciter la fluorescence avec une source impulsionnelle. Deux paramètres temporels principaux doivent alors être maîtrisés : la durée des impulsions et leur cadence. De manière générale, la durée de l’impulsion doit être bien plus courte que le phénomène que l’on doit observer. Ainsi l’excitation est ponctuelle et l’apparition temporelle du phénomène en est bien distincte.

Pour les mesures de durée de vie de fluorescence, on souhaite donc des impulsions de l’ordre de quelques picosecondes ou moins. Quant à la durée entre deux impulsions consécutives, elle doit être plus longue (3 à 10 fois plus longue) que le phénomène observé pour laisser le temps au système de se relaxer, de se désexciter. Ainsi si on souhaite pouvoir observer des temps de fluorescence plus longs, il faut une cadence plus basse. Cette dernière ne doit cependant pas être trop faible pour ne pas engendrer des temps d’acquisition interminables. Ainsi des cadences comprises entre 1 et 100 MHz sont désirées. Enfin, spectralement, la source utilisée doit permettre d’exciter le (ou les) fluorophore(s) étudié(s). L’apparition et le développement des sources laser ont joué un rôle prépondérant dans la place importante qu’occupe aujourd’hui la microscopie de fluorescence dans l’imagerie du vivant. En effet, avec de telles sources, il est possible de travailler avec des longueurs d’ondes très diverses, couvrant un spectre de l’ultraviolet à l’infrarouge, et de générer des impulsions ultracourtes. La forte densité spectrale et la qualité spatiale des faisceaux laser permettent d’exciter efficacement un grand nombre de fluorophores. De plus, la maîtrise théorique et technologique de ce type de sources permet actuellement de façonner les trains d’impulsions à façon. C’est donc tout naturellement que ces sources lasers sont à la base de la plupart des systèmes d’excitation de la fluorescence. Pour faire de l’imagerie de temps de vie de fluorescence dans le domaine temporel, différentes sources laser impulsionnelles sont utilisées dans la littérature. La référence absolue depuis plus de 10 ans est le laser à saphir dopé au titane (ou Ti:saphir) à verrouillage de modes en phase par effet Kerr. Comme son nom l’indique, le milieu amplificateur de ce laser est une matrice de saphir (Al2O3) dopée avec des ions titane (Ti3+). Les caractéristiques spectroscopiques de cet ion permettent non seulement d’avoir des impulsions courtes (d’une dizaine de fs à quelques ps), mais également d’avoir une accordabilité en longueur d’onde (de 680 à 1020 nm en routine et jusqu’à 1080 nm pour les dernières générations). Ce cristal est pompé optiquement à 532 nm, dans la plupart des cas avec un laser néodyme (Nd:YAG ou Nd:YVO4) doublé en fréquence.

Des efforts technologiques importants ont permis à ces lasers Ti:saphir d’atteindre des niveaux de fiabilité et de simplicité d’utilisation importants, et ainsi d’envahir les plates-formes d’imagerie. Aujourd’hui, les principaux fabricants de lasers (essentiellement Spectra Physics et Coherent) proposent ces sources, vendues clés en mains, extrêmement simples d’utilisation, robustes et qui nécessitent très peu d’entretien (figure 2-1). Ces systèmes délivrent des trains d’impulsions fs à des cadences comprises entre 75 MHz et 100 MHz, avec une accordabilité dans le rouge et le proche infrarouge. Pour certaines applications, notamment sur des dispositifs à balayage, les lasers Ti:saphir sont utilisés tels quels pour faire de la fluorescence par excitation à deux photons [Soper 1994], [Pelet 2006], [Kumar 2007], [Deniset-Besseau 2007]. En imagerie plein champ, la fluorescence est usuellement excitée par des processus d’absorption à un photon : dans ces conditions, le faisceau du laser est étendu spatialement et doublé en fréquence grâce à des cristaux non linéaires pour atteindre des longueurs d’ondes visibles [Elangovan 2002]. Les lasers Ti:saphir commerciaux ont des cadences relativement élevées (de 75 à 100 MHz), ce qui limite les temps de vie de fluorescence mesurables.