Etude du greffage de PBLG sur un squelette PS modifié

Structure secondaire de PBLG30

La FTIR permet de déterminer la structure secondaire des polypeptides. Le suivi des bandes amides-I et amides-II permet de déterminer la conformation des fonctions amides du squelette peptidique. L’attribution des contributions hélice-a (enroulement gauche ou droit), feuillet-b (parallèles et antiparallèles) ou pelote est bien documentée.
Le PBLG30 est mis en solution dans CHCl3. Une goutte de cette solution est déposée sur une fenêtre de KBr et le solvant est lentement évaporé sous atmosphère saturée en CHCl3. Le chloroforme est un solvant couramment utilisé pour la préparation de film de copolymère contenant du PBLG par évaporation de solvant.[10][11] La Figure 4-18 donne l’absorbance dans la fenêtre de nombres d’ondes comprit entre 1450 et 1850 cm-1.
Figure 4-18. Absorbance mesurée par FTIR d’un film de PBLG30.
La conformation très majoritaire des chaînons PBLG30 est l’hélice-a, en cohérence avec ce qui est rapporté dans la littérature.[6] Des traces de feuillet-b sont détectées vers 1525 et 1624 cm-1. Ces traces proviennent probablement soient de coudes dans la structure des chaînes, soient de chaînes courtes sous forme de feuillet-b (polymolécularité.) Une partie des chaînes PBLG peut-être sous conformation pelote, ce qui s’expliquerait par des irrégularités dans la structure en hélice-a et par l’influence des bouts de chaînes.[15] Il est difficile de différencier les hélices-a des pelotes en FTIR, on reviendra sur ce point plus loin.

Fonctionnalité de l’extrémité N-terminale de PBLG30

Un dosage des fonctions amines primaires de l’extrémité N-terminale des PBLG30 a été mené, comme présenté dans l’article II pour le cas de PTFALL30.
Une quantité précise de PBLG30 (25 mg, 3.75 10-6 mol) est soigneusement pesée et solubilisée dans DMF D7 (0.75 g). Une solution contenant une quantité précise d’aldehyde BTBFA (20 mg, 8.26 10-5 mol) et de référence TFT (7 mg, 4.7 10-5 mol) est préparée dans DMF D7 (2.08 g). Le spectre RMN 19F de la solution de BTBFA et TFT dans DMF D7 est donné Figure 4-19. Le pic correspondant à l’alcool 3,5-(bistrifluorométhyl)benzylique fluoré correspond à 5.3 % de la quantité d’aldehyde introduite. 381 mg de la solution de BTBFA et TFT sont additionnés à la solution de PBLG30. Cette quantité correspond à 1.43 10-5 mol de BTBFA, après déduction des 5.3 % d’alcool benzylique fluoré. Le spectre RMN 19F du mélange obtenu est donné Figure 4-20 (temps de réaction = 3h).
Deux contributions sont attribuées à la formation de l’imine fluorée à l’extrémité Nterminale du PBLG30. Un singulet centré à d = 56.69 ppm, et un multiplet compris entre les déplacements chimiques 56.58 et 56.65 ppm. Ces contributions ressemblent par la forme des signaux à celles obtenues pour le dosage de PTFALL30 par la BTBFA. 18.2 % de l’aldehyde initialement introduite a réagit, ce qui correspond à 2.61 10-6 mol de BTBFA. Le taux de fonctionnalisation amine primaire des chaînons PBLG30 est donc.

Greffage de PBLG30

Malgré la mise en évidence que la fonctionnalité –NH2 de l’extrémité N-terminale d’une partie des chaînes de PBLG30 est perdue ou inaccessible à la BTBFA, l’espoir était présent que la perte de fonctionnalité provenait essentiellement de la précipitation/purification préalable des chaînes de PBLG. Ce phénomène a déjà été suggéré dans des études par Kricheldorf.[16] Selon cette supposition, si une solution de squelette PS-co-Anh est ajoutée directement à la fin de la polymérisation, la perte de fonctionnalité serait contournée (greffage direct). La réaction de polymérisation de PBLG30 a été réalisée dans les mêmes conditions que celles présentées ci-dessus. Le greffage de ces polypeptides sur le PS-co-Anh est fait dans le DMF et a été réalisée tout de suite après l’étape de polymérisation, sans purification préalable des chaînons polypeptidiques. Le greffage est suivit par SEC.
Pour la polymérisation du PBLG30, les quantités de tous les composants ont été multipliées par trois par rapport à la polymérisation présentée ci-dessus, la concentration restant la même (mNCABLG = 9.98 g, 38 mmol ; mn-hexylamine = 105 mg, 1.04 mmol, mDMF = 51 g). Cette grande quantité de solution permet de disposer d’une quantité suffisante pour réaliser les prélèvements pour la SEC (~ 0.400 mg à chaque prélèvement) et de disposer de matière pour l’étude du copolymère greffé. Après cinq heures de polymérisation, une solution de PS-co-Anh (3.1 g dans 25 g de DMF) est ajoutée dans le milieu de polymérisation.
Cette quantité correspond à un taux de greffage visé de 3.5 % molaire sur le squelette, soit un greffage sur un peu plus de 40 % des fonctions anhydrides du squelette. La température de réaction est de 20°C.

Suivi du greffage par SEC

Le suivi du greffage est réalisé grâce à la chromatographie d’exclusion stérique (SEC) dans DMF/LiBr (0.1 M) comme éluent. Pendant la réaction de greffage, une partie de la solution de DMF est prélevée et diluée dans l’éluent (dilution par un facteur 16) avant d’être injectée dans les colonnes de SEC. Les Figure 4-21 et Figure 4-22 représentent respectivement les réponses du réfractomètre et du viscosimètre pour les différents temps de réaction, indiqués sur le graphique.

Cinétique de greffage

L’état d’avancement du greffage peut-être estimé grâce au suivi réfractomètrique. Les contributions du PBLG30 et du copolymère greffé correspondant sont bien séparées (cf. Figure 4-21), ce qui n’était pas le cas pour le greffage de PTFALL30. La surface du signal réfractomètrique d’un polymère est proportionnelle à sa concentration, c (t) c(t) PBLG = dans l’éluent, à travers la relation suivante :

Etude des copolymères greffés obtenus

Cette méthode de greffage n’est pas très efficiente dans le cas de chaînons PBLG30. D’après la SEC,il reste 40 % de chaînons PBLG30 libres en mélange avec le copolymère. Les copolymères sont récupérés par précipitation dans l’eau, ce qui ne sépare pas les chaînes nongreffées du copolymère.
Une étude de ce mélange en phase solide a été réalisée. Une extraction des chaînons PBLG30 libres serait souhaitable pour purifier le copolymère, mais aucun solvant sélectif n’a été trouvé. Il faut tenir compte de leur présence pour l’observation à l’état solide.

Détermination de la structure secondaire du PBLG

FTIR

Comme présenté plus tôt, la FTIR permet d’obtenir des informations sur la structure secondaire du PBLG. La Figure 4-25 donne l’absorbance de PBLG30, de PS-co-Anh et de PSg- PBLG30/PBLG30 dans la fenêtre de nombres d’onde comprise entre 1450 et 1900 cm-1. Ces trois spectres ont été obtenus après mise en solution dans CHCl3 des polymères. Pour chaquespectre, une goutte de solution est déposée sur une fenêtre de KBr et le solvant est lentement évaporé sous atmosphère saturée en CHCl3.

DSC

Des mesures de DSC ont été menées sur le squelette seul, des chaînons PBLG30 seuls et sur le copolymère récupéré à la fin du processus de greffage, PS-g-PBLG/PBLG. Les résultats sont rassemblés sur la Figure 4-26. Les échantillons sont refroidis à -50°C avant d’être chauffés jusqu’à 250°C. Sur le signal DSC de PBLG seul, une Tg, correspondante aux parties amorphes est observée 16.2°C.
Le squelette PS-co-Anh présente une Tg aux alentours de 120°C. Cette température de transition vitreuse est supérieure à celle du polystyrène, du fait de la présence des fonctions anhydrides maléiques. La Tg est suivit par un pic de relaxation enthalpique centré à 122°C due à un relâchement de contraintes.[23]
Le signal DSC du mélange PS-g-PBLG/PBLG montre deux Tg. Une Tg correspondante au PBLG, vers 17°C, très proche de celle observée pour le PBLG pur. Une deuxième Tg, aux alentours de 97°C, correspond au copolymère greffé. Comparé au squelette seul, la Tg est diminuée de plus de 20°C. La diminution de la Tg du squelette peut s’expliquer par l’influence des greffons.[24][25] Proche de l’interface PS/PBLG, le PBLG amorphe modifie la plasticité du PS et tendent à abaisser la Tg. La diminution de la valeur de la Tg peut aussi provenir en partie de la baisse du taux d’anhydride maléique, du fait du greffage.

Observations TEM

Préparation des échantillons

Des films de PS-g-PBLG30/PBLG30 ont été réalisés par évaporation de solvant à partir de solutions à 3 % dans CHCl3. Les évaporations ont été menées pendant 3 jours sous atmosphère saturée en CHCl3. Ce solvant est couramment employé pour préparer des films de copolymères à bases de PS et de PBLG.[10][11] Les films obtenus sont recuits sous vide pendant 48h à 140°C.
Des coupes fines de 60 nm d’épaisseur ont été réalisées par microtomie. Les films ont été coupés selon plusieurs axes, afin de ne pas privilégier de direction. Les coupes ont ensuite été déposées sur des grilles de Cuivre.

Marquage

Ces échantillons ont été marqués par RuO4 en phase gazeuse, en atmosphère saturée, pendant 2 minutes. RuO4 marque les cycles benzéniques ainsi que les interfaces. Les cycles benzéniques polystyrène du squelette, ainsi que ceux des greffons PBLG sont marqués. Le contraste est assuré par le fait que dans le cas de PBLG, la densité de cycle benzénique est moins importante que dans le squelette.
Ce choix de marquage a été fait après plusieurs essais infructueux avec d’autres marqueurs. Dans un premier temps, OsO4 a été utilisé, car il avait été précédemment utilisé pour marquer spécifiquement des polypeptides.[13] Mais toutes les tentatives pour obtenir assez de contraste ont échoué. Le marquage sélectif d’ester de –benzyl-L-glutamate par l’acide phosphotungstique a été utilisé pour observer PBLG-b-PS.[14] Dans notre cas, le contraste était trop faible. L’ajout d’une proportion d’alcool benzylique, qui est censée aider à la migration de l’acide phosphotungstique a détruit les coupes.

Observations

Les observations en TEM montrent deux phases distinctes : des hétérogénéités à l’échelle du μm dans une matrice homogène. La phase noire correspond au PS, la phase claire, au PBLG. La Figure 4-27 fait clairement apparaître les hétérogénéités. Celles-ci devraient correspondre aux chaînes de PBLG non-greffées. La Figure 4-28 montre un agrandissement de la matrice. Il y a apparemment une microséparation de phase, mais la qualité du contraste n’est pas suffisante pour permettre de conclure.

Conclusion

Le greffage de chaînons homopolypeptides présynthétisés, sur une chaîne classique, paraît à première vue une méthode intéressante afin de disposer d’une voie de synthèsepratique pour la préparation de copolymères hybrides. Néanmoins, cette méthode a présenté une limitation importante dans les systèmes étudiés dans ce chapitre. L’idée était d’utiliser la fonctionnalité amine primaire de l’extrémité N-terminale d’homopolypeptides, qui est naturellement obtenue par polymérisation des NCA. Les homopolypeptides étudiés étaient des PTFALL et PBLG de DP = 30. Le polymère classique utilisé était un PS modifié par des fonctions anhydrides maléiques, répartie sur la chaîne. Les réactions de greffages étaient réalisées dans le DMF.
Dans le cas de chaînes PTFALL30, un dosage préliminaire a montré que toutes les chaînes sont fonctionnalisées à l’extrémité N-terminale par une fonction amine primaire. Lors de la réaction de greffage de ces chaînes sur le PS fonctionnalisé, il restait toujours une proportion de chaînes libres après une semaine de réaction, malgré un excès initial de près de 5 fonctions anhydride maléique par chaîne de PTFALL.
Dans le cas de PBLG30, le dosage de la fonctionnalité amine primaire a montré que 30 % des chaînes étaient non-fonctionnalisées. Une explication est donnée par la possibilité d’une réaction parasite engageant le bout de chaîne –NH2 qui réagit sur un ester latéral de la chaîne. Lors de la tentative de greffage de ces chaînes sur le PS modifié, près de 40 % du PBLG initialement introduit ne s’est pas greffé.
Sans être quantitatif, le greffage de PTFALL30 semble bien meilleur que celui de PBLG30 comme l’a montré l’étude par SEC.
Des observations en TEM de PS-g-PTFALL à l’état solide montrent une microséparation de phase dans une structuration de type co-continue, avec des phases fines et interconnectées de PS et de PTFALL. Cette structuration coexiste avec des agrégats macroscopiques constitués des chaînes de PTFALL non-greffées. Les domaines de PTFALL de la phase co-continue sont très fins et montrent une taille caractéristique très faible, de l’ordre de 5 nm d’épaisseur. Cette taille est du même ordre de grandeur que la taille de PTFALL30 structuré en hélice-a. Ces observations sont compatibles avec la taille formation de domaine monocouche d’hélices-a associées parallèlement.
Le système PS-g-PBLG/PBLG ne montre aucune structuration évidente. Des agrégats à l’échelle du micromètre correspondants au PBLG libre sont observés. Ces agrégats sont répartit dans une matrice qui ressemble à une structuration désordonnée à l’échelle de la dizaine de nanomètres.