Etude de Vulcanodinium rugosum se développant dans la lagune méditerranéenn

Sampling location and period in relation with V. rugosum abundance

 This study clearly showed that V. rugosum blooming period was related to a seasonal trend. This relation between season and proliferation of benthic dinoflagellates was described for a long time by many authors (Accoroni et al., 2012; Accoroni et al., 2015; Aissaoui et al., 2014; Chang et al., 2000; Cohu et al., 2011; Rhodes et al., 2000; Turki, 2005). In this study, V. rugosum abundance were related to spring, summer and beginning of autumn periods like other benthic species in Mediterranean costal water in particular Ostreopsis (Accoroni et al., 2015; Blanfuné et al., 2015; Cohu et al., 2013). In a relative small area like Ingril lagoon, we showed a heterogeneity of V. rugosum abundance between sampling stations even if it was not statistically significant. These variations at a small scale were previously reported for Ostreopsis ovata by Cohu (Cohu et al., 2013; Cohu et al., 2011). 4.2 Impact of temperature and salinity on V. rugosum abundance As others dinoflagellate, V. rugosum proliferation in the water column of Ingril lagoon was clearly related to the variation of the water temperature. In this study, in water column, the optimum growth range was estimated between 21 °C to 28 °C. These results for V. rugosum are in accordance with results described in laboratory by Abadie et al. (2015b). In the study, V. rugosum optimum temperature was 25 °C. In this study, the maximum temperature was observed for a temperature of 23.9 °C and and a salinity of 40.5. In the laboratory study, V. 150 rugosum was able to grow between 20 °C and 30 °C. These results are consistent with those of prior retrospective studies. For the benthic species Ostreopsis, the favorable temperature range between 22 °C to 30 °C according to different studies in Mediterranean waters (Aligizaki & Nikolaidis, 2006; Cohu et al., 2013; Cohu et al., 2011; Mangialajo et al., 2008). But this relation seemed to be more complex, Vila (Vila et al., 2001a) described a bloom of Ostreopsis along the Costa Brava from a temperature of 18 °C. For another species, Prorocentrum lima, Assaoui (Aissaoui et al., 2014) showed an optimum temperature for this benthic dinoflagellate in the Golf of Tunis, ranged from 23.1 °C to 30.2 °C. In the same way, Armi (Armi et al., 2010) described blooms of Coolia monotis for temperature higher than 22 °C. These results from prior studies and obtained in Ingril lagoon, confirm that temperature is one of the most important factor to explain the proliferation of benthic dinoflagellate in Mediterranean waters (Penna et al., 2006). In our study the spearman correlation coefficient showed clearly this relation (r = 0.658 and p < 0.01). As described by Rhodes (Rhodes et al., 2011b)., the V. rugosum life cycle shows typical motile vegetative cells and unornamented non-motile cells. The motile cells (similar as a pelagic stage) are observed in the water column. Non motile cells are mainly founded on macrophyte. As it was observed for motile cells, the V. rugosum abundance on macrophyte was related to the temperature (r = 0.460 and p < 0.01). This relation was in accordance with previous studies cited above for others benthic species as Ostreopsis, Prorocentrum lima and Coolia monotis in mediterranean waters (Aissaoui et al., 2014; Aligizaki & Nikolaidis, 2006; Armi et al., 2010; Cohu et al., 2013; Cohu et al., 2011; Mangialajo et al., 2008) even if the temperature range for observed V. rugosum abundance on macrophyte was larger than that for the abundance in the water column (11.6 °C to 26.6 °C and 21 °C to 29 °C respectively). This difference between optimum ranges of temperature was previously showed by Vila (Vila et al., 2001a) for Ostreopsis in the Mediterranean Costa Brava waters (Spain) while others studies on Ostreopsis showed an optimum of temperature ranged between 22 °C and 30 °C (Aligizaki & Nikolaidis, 2006; Cohu et al., 2013; Cohu et al., 2011; Mangialajo et al., 2008). In our study, it was demonstrated that salinity was also an important factor to explain V. rugosum abundance in water column and on macrophyte with a positive correlation. These results are in accordance with a laboratory study (Abadie in preparation) where a growth of Vulcanodinium rugosum was showed between a salinity varying from 20 to 40 with an optimum at 35. This study also showed that V. rugosum could grow at a low temperature (20 °C) with a small growth rate at only salinity ranged from 35 to 40. To our knowledge no data 151 are available on V. rugosum proliferation in natural sea waters. However, for others benthic species in Mediterranean waters, some studies showed values in the same ranges. Aissaoui (Aissaoui et al., 2014) observed a bloom of Prorocentrum lima in the Golf of Tunis for a salinity between 36.1 and 40.3 with a positive correlation ( r = 0.623 and p < 0.05). In the same way, Armi (Armi et al., 2010) founded that Coolia monotis could bloom for salinity higher than 38.6. On the contrary, Penna (Penna et al., 2006) demonstrated a negative correlation between harmful taxa density and salinity in Adriatic sea but the taxa observed were dinoflagellate pelagic species (lipophilic toxins and yessotoxins producer) or benthic diatoms (Domoïc Acid producer). The main characteristic of the French Mediterranean coastal lagoons, is the important seasonal variation of the salinity. In winter during rainy storms, the salinity can dip until values less than 20 and in summer the salinity often exceed the value 40 (REPHY monitoring network data). For V. rugosum, his capability to grow at high value of salinity could be an advantage on other harmful species. 4.3 V. rugosum abundance related with nutrients Ingril lagoon is a part of a set of 8 lagoons in the French Mediterranean coast named “Palavasiens” lagoons. These lagoons were strongly impacted until 2005 by the wastewater treatment plant of Montpellier (MAERA). The wastewater was rejected after treatment (- 80 % of phosphorus and – 70 % of total nitrogen) in the Lez river who was in connection with the lagoon by the channel “canal du Rhône à Sète”. After 2005, the wastewater was directly rejected in the Mediterranean Sea. Ingril lagoon was one of less impacted by the MAERA wastewater plant. From this date the monitoring network (Réseau de Suivi Lagunaire RSL) and in particular during a three year survey, showed low concentrations of NO2, NO3, NH4, DIN, TN, TP and N:P ratio (maximum concentration measured 0.15, 2.1, 3.67, 4.05, 51.57, 2.22 and 50.67 respectively). In comparison, for the other “Palavasiens” lagoons, for the same survey, founded an important range of values for nutrients. NO2 varied from 0 to 3.37 µmol/L, NO3 from 0 to 71.66 µmol/L, NH4 from 0 to 21.62 µmol/L, DIN from 0.02 to 74.96 µmol/L, TN from 11.69 to 315.65 µmol/L, TP from 0.25 to 25.79 µmol/L and N:P ratio from 4.38 to 105.80. These results showed that Ingril lagoon is low eutrophicated and the N:P ratio highlight a phosphorus limitation rather than nitrogen limitation (RSL monitoring) contrary to the oligotrophic Mediterranean sea (Béthoux et al., 1998). In this study, the V. rugosum density in water column and on macrophyte was related positively to TN and to TP and 152 negatively to NO2, NO3, NH4 and DIN. These results are in accordance with a laboratory study. In fact Abadie et al. (2015a) showed that V. rugosum could grow in a medium with urea as only nitrogen source (no significant difference between growth rate with other nitrogen source : NO3, NH4). Authors had supposed that this behavior may give to this dinoflagellate a competitive advantage in situ, since organic nutrients could represent a significant source of nitrogen (Burkholder et al., 2008). These results are in accordance with results of previous studies for others benthic species. Cohu (Cohu et al., 2013) showed a negative correlation between nitrate concentration and Ostropsis abundance and a positive correlation with Phosphorus while others studies (Accoroni et al., 2015; Cohu et al., 2011) founded no correlation with nutrients for the same benthic species. For Prorocentrum, Aissaoui (Aissaoui et al., 2014) showed a negative correlation between P. lima density and NH4 and N:P ration among other DIN while the author founded a positive correlation with P. emarginatum abundance and NO2. Armi (Armi et al., 2010) highlighted a positive correlation between the proliferation of Coolia monotis and NO3. These results suggest that benthic dinoflagellates depend on their habitats (eutrophicated or not enclosed areas like lagoons or oligotrophic sea waters). In mediterranean lagoons, the availability of phosphorus in water impact dinoflagellates bloom (Chikhaoui et al., 2008; Hadjadji et al., 2014; Sakka Hlaili et al., 2006). It is collectively described that lagoons sediments released phosphorus in summer due to frequent anoxic conditions (Gomez et al., 1999; Markou et al., 2007; Zaaboub et al., 2014) and therefore, it may promote dinoflagellate blooms. 4.4 Substrate preference for V. rugosum on macrophyte In our study, we founded significant V. rugosum abundance on three different macrophyte species (Chaetomorpha, Zoostera noltii and Ulva rigida). We identified and sampled four different species. The lack of significant abundance of V. rugosum on gracilaria is certainly linked to its spacial distribution that more of its type. However, many previous studies showed that benthic species and in particular for Ostreopsis the type of substrate (macrophyte species) was strongly related to dinoflagellate cells abundance (Aligizaki & Nikolaidis, 2006; Cohu et al., 2013; Mangialajo et al., 2008; Vila et al., 2001a). Unfortunately due to the small scale and the strong heterogeneity between sampled stations, we cannot conclude on an impact of substrate on the V. rugosum abundance in Ingril lagoon. 153 5. Conclusion This study showed clearly that V. rugosum was spatially distributed in every sampling stations of Ingril lagoon with a higher abundance in the South of the lagoon (no significant statistically). Except for two station (INST3 and INST10) the V. rugosum abundance in water column was related to the period of sampling (June to September). Results highlighted the importance of temperature and salinity on the density of this dinoflagellate in this lagoon and explained the bloom period. The survey also showed that V. rugosum abundance is positively related to total nitrogen, total phosphorus and phosphate and negatively correlated with nitrite, nitrate, ammonium and DIN. However, this study didn’t show any significant relation between epiphytic cells and substrate. In conclusion, this study allowed us to discriminate several active environmental factors on V. rugosum proliferation in this low, eutrophicated, Mediterranean lagoon. This study confirm that V. rugosum is a thermophilic and osmotrophic organism as shown in laboratory experiment. Further studies should be carried out to investigate the occurrence of this neurotoxic dinoflagellate on others close Mediterranean lagoons like Thau lagoons where economic activities (tourism and oyster farming) could be negatively impact by the proliferation of Vulcanodinium rugosum.

Toxicité atypique due à la Pinnatoxine G (PnTX-G) produite par Vulcanodinium rugosum. 

Evaluation d’une méthode d’échantillonnage passif des des toxines lipophiles et des PnTX-G présentes dans la colonne d’eau 1. Contexte et objectifs de l’étude Les Pinnatoxines ont d’abord été isolées à partir d’un extrait de coquillages de l’espèce Pinna attenuata Reeve, prélevé sur le site de Guangdong en Chine (Zheng et al., 1990) sans pour autant que sa structure puisse être décrite. Par la suite, c’est sur le site de l’ile d’Okinawa au Japon, que les Pinnatoxines ont été pour la première fois décrites à partir d’un extrait de coquillages appartenant à l’espèce Pinna muricata (Chou et al., 1996; Uemura et al., 1995). Les pinnatoxines sont très toxiques pour les souris puisqu’elles peuvent entraîner, à des faibles doses (de l’ordre de quelques μg de PnTX) (Selwood et al., 2010), des symptômes neurologiques suivis d’une mort rapide (temps de survie inférieur à 20 min). L’organisme producteur des pinnatoxines est resté longtemps inconnu jusqu’à la découverte récente de la toxicité associée à Vulcanodinium rugosum, isolé dans les eaux de de la Nouvelle-Zélande (Rhodes et al., 2011a). En France, la mise en évidence des pinnatoxines en 2010 puis de V. rugosum (Nézan & Chomérat, 2011) a permis d’expliquer rétrospectivement les cas de toxicités atypiques, observés depuis 2006 chez des moules et des palourdes récoltées dans la lagune d’Ingril. Il s’agit donc de risques supplémentaires et nouveaux d’intoxication pour les consommateurs de coquillages en France qui peuvent être également un frein à l’exportation. Le premier objectif de ce travail a été de mesurer les concentrations de Pinnatoxines G et A présentes dans la chair de trois mollusques filtreurs de grande grande importance économique pour la région, la moule Mytilus galloprovincialis, l’huître Crassostrea gigas et la palourde Venerupis decussata récoltées dans la lagune méditerranéenne de l’Ingril. Pour répondre à cet objectif, une méthode d’analyse en tandem par chromatrographie et spectrométrie de masse particulièrement sensible a été mise au point afin de mettre en évidence les différents niveaux de contamination de ces mollusques. Le deuxième objectif a été de mettre en évidence la production de pinnatoxines par le dinoflagellé V. rugosum se développant dans la lagune de 163 l’Ingril, dont les cellules sont ingérées par les mollusques filtreurs qui alors bioaccumulent les toxines algales. Par ailleurs, les biotoxines marines représentent un problème important mondialement partagé. Ces composés impactent régulièrement et fortement la conchyliculture et la pisciculture. De nombreux pays ont mis en place des réseaux de surveillance du phytoplancton et des phycotoxines. Cependant ces réseaux traditionnels, même s’ils ont prouvé leur efficacité, ne représentent qu’une vision instantanée d’un bloom (1 point à 1 moment précis) (Lane et al., 2010) et ces systèmes ne prennent pas en compte les organismes trop petits (< 20 µm) ni les espèces épi-benthiques. Pour ces raisons, les échantillonneurs passifs (SPATT : Solid Phase Adsorption Toxin Tracking) ont été développés et testés pour accumuler les biotoxines libérées dans l’eau de mer par les microalgues toxiques lors des blooms (MacKenzie et al., 2004). Ces systèmes présentent l’avantage de fixer les toxines sans les transformer (ce qui est souvent le cas pour les coquillages qui bio-transforment les toxines) et donc facilite leur identification ainsi que l’organisme producteur en fonction de ce profil de toxines. Ces SPATTs sont généralement constitués d’un support (sac, …) permettant de maintenir la résine adsorbante. Ces résines sont choisies en fonction de leur structure et donc de leur affinité supposée envers ces biotoxines. Une fois les SPATTs récupérés, les toxines sont séparées de la résine grâce à des éluants adaptés aux biotoxines recherchées (d’où la nécessité de phase de test). Cependant, il apparu intéressant d’approfondir ces résultats en employant d’autres phases, utilisées actuellement plus particulièrement pour la recherche de contaminants chimiques tels que les pesticides ou les produits pharmaceutiques, notamment par le biais des échantillonneurs de type POCIS (Mackenzie, 2010). Cette approche devrait permettre d’accumuler les toxines présentes dans l’eau de mer à de faibles concentrations et d’envisager leur quantification, ce qui est actuellement impossible directement étant donné leur faible concentration dans la colonne d’eau. Une fois validées en laboratoire (type de résine, taux de récupération, choix du meilleur éluant), les techniques d’échantillonnage passif ont été appliquées in situ (Ingril) pendant deux années consécutives afin de suivre la présence ou non d’une contamination et son évolution. Ainsi, nous avons examiné si cette technique d’échantillonneurs passifs présentait un intérêt pour la surveillance des eaux lagunaires, notamment dans les zones conchylicoles. Plus particulièrement, cette approche devrait permettre une détection rapide des toxines produites par des algues benthiques ou épiphytes dans la colonne d’eau car l’observation de ces algues demeure délicate. 

 Résumé des articles

 La pinnatoxine G responsable de toxicité atypique dans la moule Mytilus galloprovincialis, l’huitre Crassostrea gigas et la palourde Venerupis decussata de la lagune méditerranéenne de l’Ingril. Résumé. Lors de l’analyse sanitaire par bio-essais de coquillages prélevés dans la lagune de l’Ingril, des mortalités atypiques de souris ne pouvant être causées par les toxines lipophiles connues ont été constatéesNotre travail a montré que la Pinnatoxine G (PnTX-G) était à l’origine de ces mortalités. Les analyses par chromatrographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) de la chair de moules de l’Ingril collectées entre 2009 et 2012 ont indiqué que la PnTX-G etait présente en quantité suffisante pour expliquer les mortalités atypiques observées. Les niveaux de PnTX-G dépassaient 40 µg kg-1 dans la chair totale avec un maximum de 1200 µg kg-1 en septembre 2010. Ces concentrations étaient très supérieures à celles mesurées dans 10 autres sites qui présentaient des concentrations inférieures à 10 µg kg-1. Les moules étaient plus contaminées que les palourdes, ce qui a confirmé que la moule était une espèce sentinelle de choix et adaptée pour la surveillance des pinnatoxines. Les profils toxiniques ont indiqué que la concentration en pinnatoxine A dans les moules était inférieure de 2% à celle de la PnTX-G et que les ptériatoxines étaient présentes à des concentrations inférieures au seuil de sensibilité. L’activité de la pinnatoxine G naturelle a été comparée au standard de pinnatoxine G en utilisant la technique développée par Aráoz et al (2012) sur microplaque en se basant sur le mode d’action agoniste / antagoniste sur le récepteur nicotinique de l’acétylcholine. Les résultats montrent que la PnTX-G naturelle avait une activité similaire que celle de la PnTXG de synthèse. L’analyse des cellules d’une culture monoclonale de V. rugosum (IFR-VRU01) isolée de l’Ingril confirme que cette algue produit de la PnTX-G (4.7 pg cell-1). L’absence de cette microalgue dans la colonne d’eau durant une période importante de la contamination des mollusques et la dominance de stades non mobiles du cycle de vie de V. rugosum suggèrent la nécessité de la mise en place d’études sur l’écologie de ce dinoflagellé et sur la cinétique d’accumulation des pinnatoxines dans les mollusques.