Etude de p76, une nouvelle protéine mannose-6-phosphate

Les compartiments de la voie endocytaire

La voie endocytaire est classiquement décrite comme formée de trois types de compartiments : les endosomes précoces, les endosomes tardifs et les lysosomes.
Les endosomes sont des plateformes de tri qui séparent les molécules qui doivent être recyclées (par exemple, le récepteur aux lipoprotéines de basse densité (LDL pour Low Density Lipoprotein) (Brown et al., 1983) de celles qui doivent être dégradées (la particule de LDL). Une caractéristique importante de la voie endocytaire est qu’elle est progressivement acidifiée par une V-ATPase. Ce gradient de pH contrôlé est essentiel pour la séparation entre le récepteur et son ligand (Mellman et al., 1986). Les récepteurs membranaires qui sont destinés à être dégradés sont signalés par une mono-ubiquitine qu’ils acquièrent lorsqu’ils sont activés sur une lysine de leur queue cytoplasmique.
Ce signal déclenche le recrutement d’une machinerie cellulaire capable de séquestrer les récepteurs et de les transporter jusqu’aux lysosomes.
L’étude des compartiments de cette voie s’est faite principalement par des observations morphologiques en microscopie électronique ou en immunofluorescence ou par des fractionnements biochimiques des compartiments. Plus récemment, le développement de la vidéomicroscopie a permis d’étudier la dynamique de cette voie à l’échelle moléculaire. Actuellement, il est difficile d’avoir une vision d’ensemble de ces compartiments qui intègrerait les données biochimiques et morphologiques, d’autant que ces données peuvent varier selon le modèle cellulaire. De plus, certains auteurs n’utilisent pas le même terme pour désigner ce qui semble être un même compartiment, ou discutent l’existence d’un compartiment décrit par d’autres. Ainsi, les paragraphes suivants se limitent aux données consensuelles sur les différents compartiments classiquement décrits de la voie endocytaire.

La dynamique de la voie endocytaire

La dynamique des compartiments de la voie endocytaire fait l’objet de controverses notamment pour le passage de l’endosome précoce vers l’endosome tardif : la théorie des « compartiments stables » propose que les endosomes précoces et tardifs sont des compartiments pré-existants et stables, alimentés via un trafic de vésicules qui leur apportent les cargos, à l’image des compartiments de la biosynthèse (Griffiths and Gruenberg, 1991). L’autre théorie, dite de «maturation des compartiments», semble la plus admise aujourd’hui ; elle postule que les endosomes précoces sont formés de novo par la fusion des vésicules qui arrivent de la membrane plasmique. Leur composition change, certaines molécules étant recyclées et d’autres arrivant du TGN, et ils deviennent ainsi peu à peu des endosomes tardifs, puis finalement des lysosomes. Un modèle récent décrit un endosome intermédiaire entre les endosomes précoces et endosomes tardifs. Celui-ci a été nommé « coated endosome » ou « endosome mantelé », du fait de la présence d’une bicouche plate de clathrine qui couvre certaines zones de ces endosomes (Bonifacino and Rojas, 2006). Bien que le rôle de cette bicouche de clathrine ne soit pas encore élucidé, elle semble jouer un rôle dans la séquestration des récepteurs ubiquitinylés qui vont être concentrés dans les vésicules intraluminales des MVB (Raiborg et al., 2003). L’endosome mantelé comprend également un vaste réseau tubulaire, dans lequel chaque tubule serait dédié à une fonction de recyclage ou de tri spécifique. Par exemple, un ou plusieurs tubules permettraient le transport rétrograde vers le TGN de toutes les protéines impliquées dans les mécanismes de recrutement, de bourgeonnement, d’ancrage et de fusion de membranes et d’autres seraient dédiés au recyclage des récepteurs à la membrane plasmique .

L’endocytose via les radeaux lipidiques et les cavéoles

Il existe une voie d’endocytose connue depuis longtemps, dans laquelle les vésicules d’internalisation sont appelées cavéoles. Les cavéoles sont de petite taille (50 à 150 nm de profondeur) et sont décrites comme ayant une forme d’oméga inversé. Elles sont particulièrement abondantes dans les cellules endothéliales où elles opèrent la transcytose de molécules du sang vers l’espace intersticiel. On sait aujourd’hui que les cavéoles sont des radeaux lipidiques contenant la cavéoline-1, une petite protéine membranaire intégrale ayant une forte affinité pour le cholestérol, qui est à l’origine de la forme particulière des ces vésicules. Les radeaux lipidiques (ou « lipid raft ») sont des microdomaines lipidiques riches en cholestérol et en sphingolipides. Ils ont été isolés grâce à leur propriété d’insolubilité dans les détergents non ioniques à froid, mais ont également été observés avec des techniques de microscopie. Les protéines habituellement enrichies dans les radeaux lipidiques sont les protéines à ancre GPI (pour Glycosyl PhosphatidylInositol), des protéines acylées, des récepteurs couplés à la protéine G, les tyrosine kinases, ainsi que les lipides servant de messagers secondaires. Ces radeaux sont des plateformes membranaires dédiées à la signalisation cellulaire (Simons and Toomre, 2000). Les cavéoles auraient une double fonction de plateformes de transduction du signal et d’endocytose, et elles pourraient contrôler des cascades de signalisation en ciblant des molécules du signal vers des compartiments intracellulaires précis (Shaul and Anderson, 1998).
De plus en plus de données indiquent qu’il existe une voie d’endocytose médiée par les radeaux lipidiques. C’est par cette voie que le récepteur β de l’interleukine-2 (Lamaze et al., 2001) ou certains antigènes comme le virus non-enveloppé SV40 (Damm et al., 2005) sont internalisés. Elle est subdivisée en voies dépendante et indépendante de la dynamine. Ainsi, la voie via les cavéoles serait une forme spécialisée de la voie dépendante de la dynamine, avec une morphologie particulière des radeaux lipidiques dûe à la présence de la cavéoline-1. La machinerie moléculaire de ces voies, qui représenteraient la forme la plus primitive de l’endocytose, est encore très peu caractérisée (Kirkham and Parton, 2005).

Le contenu soluble du lysosome : les hydrolases acides

Le lysosome renferme plus de 50 hydrolases solubles, qui sont actives de manière optimale à pH acide. L’ensemble de ces hydrolases est capable de dégrader toute sorte de substrats soit pour les réduire en molécules simples soit pour les transformer en un métabolite spécifique. Presque chacune de ces enzymes est associée à une pathologie dans le cas où son activité est déficiente. Ces pathologies sont appelées « maladies de surcharge » .
Les protéases lysosomales comprennent les cathepsines, qui sont pour la plupart des endopeptidases. Certaines sont exprimées de manière ubiquitaire (par exemple les cathepsines C, D et O), d’autres sont plus spécifiques de certains tissus, comme la cathepsine K dans les ostéoclastes, dans les cellules épithéliales des poumons et de la thyroïde. Ces enzymes ont un rôle important dans le catabolisme lysosomal des protéines, mais elles interviennent également en dehors du lysosome, dans le cadre de l’homéostasie des tissus. Elles sont parfois sécrétées pour dégrader la matrice extracellulaire.
Par exemple, lors d’une ablation de la prostate ou du sein, l’expression de la cathepsine B est beaucoup plus élevée dans les glandes en cours de régression que dans celles à l’état normal. Les cathepsines B, K, L, D interviennent aussi dans la maturation de la thyroglobuline en thyroxine dans la matrice extracellulaire de la thyroïde. Ces enzymes sont régulées par des inhibiteurs, comme les cystatines ou les stefines, mais leur activation est également un processus contrôlé. Par exemple, la pro-cathepsine D humaine de 53 kDa ne devient active que lorsque son pro-peptide est clivé, démasquant alors le site actif. Puis cette chaîne de 47 kDa est clivée en deux chaînes de 14 et 31 kDa. Le processus exact de sa maturation n’est pas encore totalement élucidé, même si vraisemblablement elle combine une autocatalyse à pH acide et l’intervention d’autres protéases.

Les protéines membranaires lysosomales

La membrane du lysosome a un rôle important de séquestration des enzymes lysosomales à l’écart du reste du cytoplasme. Sans cette membrane, ces enzymes pourraient avoir un rôle dévastateur pour l’intégrité de la cellule. Cette membrane assure aussi la fusion entre les lysosomes et d’autres organites (les endosomes tardifs, le phagosome, par exemple) ou le transport vers le cytoplasme des métabolites obtenus après dégradation, grâce à des transporteurs membranaires.
Les protéines membranaires les plus abondantes sont les LAMPs (pour Lysosomal Associated Membrane Protein) et les LIMPs (pour Lysosomal Integral Membrane Protein), qui représentent environ 50 % des protéines de la membrane des lysosomes et des endosomes tardifs. Leur queue cytosolique est très courte (une dizaine d’acides aminés), à l’inverse de leur domaine luminal. Celui-ci porte de nombreuses glycosylations de type poly-N-acetyllactosamines qui forment une barrière dense sur la face intérieure du lysosome appelée « glycocalix ». Il a été proposé que ces glycosylations protègent la membrane du lysosome contre les hydrolases qu’elle renferme (Fukuda, 1991). Cependant, une étude récente a montré que ces glycosylations servent en fait à protéger les protéines LAMP-1 et LAMP-2 de la dégradation par les protéases. Non glycosylées, ces protéines sont dégradées dans la membrane du lysosome, alors que les lysosomes conservent leur propriétés (pH, osmolarité, densité) et leur fonction dégradative (Kundra and Kornfeld, 1999). La fonction des protéines LAMP a été étudiée grâce à des souris « knocked-out » (K.O) pour ces gènes. Les souris déficientes en LAMP-1 sont viables et fertiles, les tissus sont normaux ou peu affectés, et les lysosomes sont identiques aux lysosomes contrôles. Il a été remarqué que la protéine LAMP-2 était plus abondamment exprimée dans ces souris, probablement pour compenser la déficience en LAMP-1 (Andrejewski et al., 1999). Les souris K.O. pour LAMP-2 présentent en revanche un phénotype avec des symptômes graves : la moitié des souris meurent un mois après la naissance ; elles sont beaucoup plus petites que les souris contrôles. L’observation en microscopie électronique révèle une accumulation de vacuoles d’autophagie dans des organes comme le foie, le cœur et les muscles (Tanaka et al., 2000). Chez l’homme, la maladie qui correspond à une déficience en LAMP-2 est appelée maladie de Danon. L’inactivation des deux gènes codant pour LAMP-1 et LAMP-2 est létale, les souris meurent à l’état embryonnaire (Eskelinen et al., 2004). Récemment, il a été montré que ces deux protéines LAMP-1 et LAMP-2 permettaient la fusion des lysosomes avec le phagosome, suggérant un rôle de ces deux protéines dans le déplacement des organites vers le centrosome .

Table des matières

INTRODUCTION
I . LA VOIE ENDOCYTAIRE
1. Les compartiments de la voie endocytaire
1. 1. Les endosomes précoces
1. 2. Les endosomes de recyclage
1. 3. Les endosomes tardifs
1. 4. Les lysosomes
2. La dynamique de la voie endocytaire
3. Les différentes voies d’entrées
3. 1. L’endocytose à récepteurs dépendante de la clathrine
3. 2. L’endocytose via les radeaux lipidiques et les cavéoles
3. 3. La pinocytose
3. 4. La phagocytose
II . LES LYSOSOMES
1. Historique
2. Composants du lysosome
2. 1. Le contenu soluble du lysosome : les hydrolases acides
2. 2. Les protéines membranaires lysosomales
3. Ciblage des protéines lysosomales
3. 1. Ciblage des protéines M6P
3. 1. 1. Le mécanisme de ciblage
3. 1. 2. Les récepteurs au M6P
3. 2. Ciblage indépendant des récepteurs au M6P
3. 3. Ciblage des protéines lysosomales membranaires
4. Fonctions des lysosomes
4. 1. Le catabolisme général
4. 1. 1. Processus de dégradation
4. 1. 2. Autophagie
4. 2. Autres fonctions des lysosomes
4. 2. 1. Fonctions ubiquitaires
4 . 2 . 1 . 1 Réparation de la membrane plasmique
4 . 2 . 1 . 2 Implication dans la mort cellulaire
4. 2. 2. Fonctions spécialisées
5. Les maladies lysosomales 
III . IDENTIFICATION DE P76
1. Données de spectrométrie de masse
2. Description du gène et de la protéine « p76 »
IV . LES PHOSPHOLIPIDES ET LES PHOSPHOLIPASES
1. Structure des phospholipides 
2. Fonction générale des phospholipides
3. Les phospholipases 
4. Les phospholipases lysosomales
V . OBJECTIFS DE LA THESE
MATERIEL ET METHODES
I . BIOLOGIE MOLECULAIRE
1. Clonage
2. Analyse en Northern blot 
3. Techniques d’interférence à ARN
II . BIOLOGIE CELLULAIRE 
1. Lignées cellulaires
2. Transfection et lignées cellulaires transfectées
3. Analyses en immunofluorescence
4. Internalisation de hp76-myc par les cellules ICD 
III . BIOCHIMIE 
1. Electrophorèse et coloration des gels
2. Western blot et overlay 
3. Déshybridation des membranes de Western blot
4. Purification des anticorps
5. Fat blots
6. Détermination de la séquence N-terminale des protéines 
7. Analyse des N-glycosylations
8. Production et purification de protéines M6P à partir de lignées cellulaires
9. Production et purification de protéines M6P à partir de cerveau de souris
10. Production et purification de protéine recombinante FLAG-hp76 
11. Production de protéine recombinante hp76-myc issue des cellules CHO/hp76-myc 
12. Production de protéine recombinante hp76-myc issue des cellules 293/hp76-myc
13. Précipitation au sulfate d’ammonium 
14. Concentration des surnageants de culture, changement de tampon
15. Purification de hp76-myc sur la colonne IMAC d’ion cobalt
16. Préparation d’une colonne d’affinité hp76-myc
17. Fractionnements subcellulaires de lignées cellulaires
18. Fractionnements subcellulaires de foies de souris
19. Expériences de choc osmotique 
20. Dosages d’activités enzymatiques lysosomales dans les fractionnements subcellulaires de foies de souris
IV . SPECTROMETRIE DE MASSE ET BIOINFORMATIQUE
1. MALDI-TOF
2. LC/MS-MS
3. Bioinformatique
V . TESTS ENZYMATIQUES D’HYDROLYSE DE PHOSPHOLIPIDES ET ANALYSE DES PRODUITS DE LA REACTION 
1. Tests enzymatiques en milieu liquide avec l’asolectine
2. Tests enzymatiques en milieu liquide avec la cardiolipine
3. Extraction des lipides
4. Migration en chromatographie en couche mince (CCM)
5. Tests d’activité en milieu liquide avec des substrats fluorescents 
6. Tests avec le NBD-PC 
7. Tests avec le bis-BODIPY PC
VI . OUTILS DEVELOPPES POUR ETUDIER P76
1. Lignées cellulaires exprimant p76 recombinante
2. Fiches d’identité des anticorps anti-p76
3. Expression et purification de p76 recombinante
3. 1. FLAG-p76
3. 2. Production de hp76-myc par les cellules CHO/hp76-myc
3. 3. Production de hp76-myc par la lignée 293/hp76-myc
RESULTATS ET DISCUSSION 
I . CHAPITRE I : CARACTERISATIONS BIOCHIMIQUES DE P76
1. Nombre de glycosylations de hp76
2. Mannose-6-phosphorylation de hp76
2. 1. Reconnaissance directe de hp76 par le sCI-MPR
2. 2. Internalisation de hp76-myc purifiée par des cellules ICD
3. Maturation de p76 chez la souris et chez l’homme
3. 1. Maturation de mp76
3. 2. Maturation intracellulaire de hp76
3. 3. Maturation de hp76 sécrétée
3. 3. 1. La protéine recombinante hp76-myc sécrétée subit un clivage majoritaire
3. 3. 2. La protéine endogène hp76 purifiée à partir des sécrétions de cellules U937 subit un clivage
similaire à celui de la protéine recombinante
3. 3. 3. Les deux chaînes N- et C-terminales sont associées par une liaison non-covalente
4. Cinétiques de l’expression de hp76 et mp76 dans des cellules transfectées transitoirement
5. Discussion
5. 1. Identification de p76
5. 2. Tous les sites de N-glycosylations de hp76 sont occupés et certains portent des sucres M6P
5. 3. p76 subit une maturation protéolytique
5. 3. 1. mp76
5. 3. 2. hp76
5. 3. 3. Comparaison des formes hp76 et mp76
II . CHAPITRE II : ETUDE DE LA LOCALISATION DE P76
1. Localisation tissulaire
2. Localisation intracellulaire
2. 1. Localisation de p76 par immunofluorescence
2. 1. 1. Expression de protéines chimères hp76-GFP ou hp76-myc
2. 1. 2. Expression de hp76 (sans étiquette)
2. 1. 3. Expression de mp76 (sans étiquette)
2. 1. 4. Conclusions sur l’approche par immunofluorescence
2. 2. Localisation de mp76 par fractionnements subcellulaires
2. 2. 1. Distribution de mp76 dans un fractionnement subcellulaire total
2. 2. 2. Distribution de mp76 dans des gradients de densité
2 . 2 . 2 . 1 Cas du fragment C-terminal mp27
2 . 2 . 2 . 2 Cas des fragments N-terminaux de mp76
2. 2. 3. Latence
2 . 2 . 3 . 1 Le fragment C-terminal mp27 est latent
2 . 2 . 3 . 2 Analyse de la bande contaminante à 29 kDa
2 . 2 . 3 . 3 Analyse des fragments N-terminaux de mp76
3. Discussion
3. 1. p76 est ubiquitaire
3. 2. p76 est peu abondante
3. 3. p76 est une protéine lysosomale
III . CHAPITRE III : FONCTION DE P76 
1. Expériences de liaison aux phospholipides
2. Tests d’activité phospholipase 
2. 1. Tests en milieu liquide et analyse des produits par CCM
2. 2. Tests en milieu liquide avec des substrats fluorescents
2. 2. 1. Phosphatidylcholine-NBD
2. 2. 2. Phosphatidylcholine Bis-Bodipy C11
3. Extinction de hp76 par interférence à ARN
3. 1. Extinction de courte durée : duplexes de siRNA
3. 2. Extinction de longue durée : transfection avec les shRNA
4. Discussion
4. 1. Extinction de l’expression de hp76
4. 2. Production et purification de hp76
4. 3. Aucune activité phospholipase A n’a pu être détectée avec hp76
4. 4. hp76-myc lie la cardiolipine
CONCLUSION ET PERSPECTIVES 
I . CONCLUSION
II . PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXE 
I . ANNEXE 1 : LA PROTEINE RECOMBINANTE FLAG-HP76 PRODUITE EN BACTERIE

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