Etude de l’interrelation entre la vache et son microbiote ruminal

Etude de l’interrelation entre la vache et son microbiote ruminal

Procédure de prélèvement de contenu ruminal (cf. figure 1, flèches noires) Le protocole de prélèvement avait une durée d’environ 10 minutes. Le matériel de prélèvement était spécifique à chaque vache ou désinfecté entre 2 animaux pour éviter les contaminations microbiennes. Il consistait à bloquer les animaux dans leurs logettes, puis à ouvrir la canule ruminale et à prélever à l’aide d’un bécher de 250 mL en 6 points pour obtenir un échantillon le plus représentatif possible du contenu ruminal. La diversité le long de l’axe antéro-postérieur a été représentée par 3 emplacements de prélèvement : un crânial, un caudale et un au centre du rumen. La diversité le long de l’axe dorso-ventrale a été représentées sur 2 hauteurs pour chacun des 3 emplacements cités précédemment, en surface du contenu ruminal, juste sous cette dernière, et au fond de l’organe. Pour chacun de ces points de prélèvement, 250 ml de contenu a été prélevé et regroupé dans un même récipient saturé au préalable avec du CO2.

Mesure des paramètres fermentaires

Les mesures présentées dans cette partie sont utilisées pour contribuer à la caractérisation des phénotypes des animaux.  pH Le pH des contenus ruminaux a été mesuré, à l’aide d’un pH-mètre, pour chacune des 6 vaches le matin avant la distribution de la ration aux jours suivants : d -43, d -39, d -36, d -34, d – 32, d -29, d -27, d -25, d -20, d -18, d -15, d -13, d -11, d -8, d -4, d -1, d 1, d 6, d 10, d 15, d 22, d 29, d 36, d 43, d 50, d 57, d 64, d 77, d 80, d 83, d 85, d 87, d 92, d 94, d 101, d 104, d 108, d 111 et d 115.  AGV et NH3 Les mesures des concentrations ruminales en AGV et en NH3 ont été réalisées simultanément à 4 reprises pendant l’expérimentation à d -42, d -7, d 77 et d 112. Durant ces journées, 4 prélèvements ont été réalisés pour estimer les concentrations moyennes journalières par vache. Le premier prélèvement a été réalisé juste avant la distribution du repas du matin, puis 4h, 6,5h et 9h après la distribution de ce repas. Une fois le contenu ruminal échantillonné, il a été filtré à travers une toile en nylon de porosité 50 µm. Cinq millilitres de ce jus ont été transférés dans un tube contenant 1 ml d’acide métaphosphorique et stockés immédiatement à -20°C pour les analyses d’AGV (Hünerberg et al., 2013). Cinq millilitres de ce jus ont été transférés dans un tube contenant 0,5 ml d’acide orthophosphorique et stockés immédiatement à -20°C pour les analyses de NH3 (Guyader et al., 2015). Les concentrations d’acétate, de propionate et de butyrate dans le jus de rumen ont été déterminées par chromatographie en phase gazeuse (CPG) dans le laboratoire Upscience (Saint Nolff, Morbihan, France). Le chromatographe en phase gazeuse est équipé d’un injecteur on-column et d’un détecteur FID Agilent 689. L’échantillon est centrifugé au préalable. Le passeur d’échantillon est automatique, le gaz make up est l’hydrogène et la colonne est semi-capillaire (Agilent CP7624). La concentration de NH3 dans les jus de rumen a été mesurée à l’aide d’une sonde spécifique (Broudiscou and Papon, 1994) au laboratoire MoSAR (Paris, France). 174  In vitro (IV) Pour obtenir des caractéristiques uniquement liées aux microbiotes ruminaux, des fermentations in vitro ont été réalisées. Les 6 vaches de cette expérimentation ont servi d’animaux donneurs d’inoculum. Il y a eu 14 incubations associées à l’alimentation distribuée aux animaux. Les incubations n°1, 2, 13 et 14 ont été réalisées avec l’aliment EM à d -43, d -41, d 111 et d 113 respectivement. Les incubations n°3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 et 12 ont été réalisées avec la ration FOIN à d -8, d -6, d 1, d 6, d 20, d 22, d 48, d 50, d 76 et d 78 respectivement comme indiqué sur la figure 1. Pour chaque incubation, 12 traitements étaient répartis entre 30 flacons. Cinq flacons étaient attribués par vache dont 2 « sans substrat » pour connaître le potentiel fermentaire de l’inoculum et 3 « avec substrat ». Les réplicats pour une même vache et pour un même substrat ont été moyennés. Chaque inoculum a été traité individuellement avec du matériel séparé pour éviter les contaminations microbiennes. Pour chacun des flacons, il a fallu 24 ml d’inoculum. Pour chaque incubation dans les 18 flacons « avec substrat », ce dernier était composé des mêmes matières premières que la ration distribuée le jour du prélèvement de contenu ruminal avec exactement les mêmes proportions de matière sèche. Tous les ingrédients ont été broyés à 3 mm sauf le foin qui a été broyé à 1 mm. Pour ces 18 flacons, 2,4 g de matière sèche ont été disposés dans chaque flacon. Un liquide tampon a été préparé (Mould et al., 2005). Le détail du protocole de préparation est présenté en annexe 3. Le tampon (216 mL) a été ajouté au flacon contenant le substrat afin de le pré-hydrater. Le matin de l’inoculation, les flacons ont été réchauffés au bain-marie à 39°C et connectés à l’AMPTS (Automatic Methane Potential Test System) de chez Bioprocess Control (Lund – Suède) avant d’ajouter l’inoculum (24 mL). Le système AMPTS était saturé avec du CO2. Après cette étape, la sortie de chaque cellule de l’AMPTS a été connectée à des poches pour collecter le gaz produit. L’incubation a duré 47h et les flacons n’ont pas été agités. Les volumes de gaz totaux produits ont été mesurés en continu. Ces données mesurées en fonction du temps ont été ajustées sur une adaptation du modèle d’Orskov sans temps de latence (Orskov and Mcdonald, 1979) : 𝑉(𝑡) = 𝑎 + 𝑏 . (1 − 𝑒𝑥𝑝−𝑐 . 𝑡 ) Avec V(t) le volume de gaz (en ml) produit à l’instant t (en h), a la fraction soluble (en ml), b la fraction insoluble (ml) et c le taux fractionnaire associé à la fraction b (en h-1). A la fin des incubations la composition des gaz a été analysée par le GEOTECH biogas 5000 (Coventry – Royaume-Uni). Pour chacune des poches de gaz, 3 fois 50 ml de gaz sont prélevés pour mesurer leur teneur en CO2 et en CH4.

Mesure des taux de passage de la phase liquide et solide dans le rumen

La caractérisation des dynamiques des contenus ruminaux se traduit dans cette expérimentation uniquement par la mesure des taux de passage de la phase liquide et solide des contenus ruminaux. Les cinétiques d’ingestion ne sont pas étudiées pour ces 6 animaux car le rationnement mis en place dans cette expérimentation conduit à une très faible variabilité du comportement d’ingestion entre les 6 vaches. Les contenus ruminaux ont été échantillonnés pour estimer les taux de passage sur 4 périodes de d -43 à d -39, de d -8 à d -4, de d 76 à d 80 et de d 111 à d 115. Le polyéthylène glycol (PEG) a été utilisé comme marqueur de la phase liquide. Le suivi de la concentration en matière minérale insoluble dans l’acide chlorhydrique (AIA) a été utilisé comme marqueur de la phase solide (Egan and Doyle, 1984). Durant ces 4 semaines de mesures, 150 g de PEG préalablement dissout dans 1 L d’eau et 1 500 g de balle de riz (source 175 d’AIA) pré-hydratée avec 6 L d’eau ont été introduits le mardi matin avant la distribution des repas dans le rumen. La partie liquide du contenu a été échantillonnée à 3, 5,5, 8, 9, 23, 32 et 47 heures après introduction du marqueur. La partie solide du contenu ruminal a été échantillonné 25, 19 et 16 h avant l’introduction de la balle de riz et 5,5, 8, 23, 29, 32, 47, 56, 71 et 80 h après l’introduction. Les contenus ruminaux ont été prélevés selon la méthodologie décrite précédemment (procédure de prélèvement de contenu ruminal). L’échantillon a été filtré sur une toile en nylon de porosité 50 µm. A partir de la fraction liquide, 3 fois 10 ml ont été introduits dans 3 flacons de 15 ml et ont été stockés à -20°C jusqu’à l’analyse. La fraction solide a été séchée à l’étuve pendant 48h à 80°C dans des barquettes aluminium et ces contenus séchés ont été conservés dans des pots hermétiques à température ambiante. Les échantillons de contenu liquide ont été analysés (MoSAR, Paris, France) pour déterminer la concentration en PEG par turbidimétrie (Hyden, 1956). Les échantillons de contenu solide pour l’analyse des insolubles chlorhydriques ont été réalisés selon le règlement CE 152/2009 (Upscience, Saint-Nolff, Morbihan, France). L’échantillon est incinéré puis les cendres ont été traitées à ébullition par l’acide chlorhydrique et le résidu insoluble ont été filtré puis pesé.