Etude de l’interaction entre EFA6 et l’endophiline

Afin de confirmer les résultats obtenus en double hybride, nous avons réalisé des expériences de pull-down sur des lysats cellulaires sur-exprimant nos protéines d’intérêt. Nous avons pu observer qu’EFA6A interagit avec des isoformes représentants les deux familles d’endophiline, soit l’endophiline A1, l’endophiline A2 et l’endophiline B1. Nous avons pu mettre en évidence, par l’utilisation de protéines purifiées que cette interaction est directe et qu’elle se fait par l’intermédiaire du domaine Sec7 d’EFA6 et des 125 premiers acides aminés du domaine N-BAR de l’endophiline A1. Ces deux domaines étant importants pour les fonctions de ces deux protéines, nous avons ensuite étudié les effets de cette interaction sur leurs activités respectives. Nous avons observé qu’in vitro l’endophiline A1 stimule l’activité d’échange d’EFA6 sur de l’Arf6 myristylé en présence de vésicules de grande taille. Ces résultats suggèrent qu’EFA6 est capable de lier simultanément Arf6 et l’endophiline, et que par cette interaction l’endophiline joue un rôle de régulateur positif sur l’activité catalytique d’EFA6. Par des expériences de flottaison sur gradient de sucrose et de pull-down en présence de vésicules artificielles, nous avons mis en évidence une compétition entre le domaine Sec7 et les lipides pour la liaison au domaine N-BAR. Dans nos conditions expérimentales nous observons que l’interaction entre EFA6 et l’endophiline est contrôlée par la courbure membranaire. En effet, les expériences de pull down montrent que la présence de vésicules à fort degré de courbure dissocie le complexe EFA6/endophiline. Alors que le domaine N-BAR seul se retrouve dans la fraction Top liée aux vésicules mimant une membrane plane à la suite de l’expérience de flottaison, on le retrouve dans la fraction Bottom en présence du domaine Sec7. Ceci est en faveur d’un effet dissociateur du domaine Sec7 sur l’interaction entre le domaine N-BAR et les membranes planes. Ces résultats mettent en évidence pour la première fois le contrôle d’une interaction protéine-protéine par une courbure membranaire. Nous avons pu observer par des expériences de diffusion dynamique de lumière et de microscopie électronique que l’endophiline A1 déforme et tubularise des vésicules de grande taille et que cet effet est inhibé en présence du domaine Sec7 d’EFA6. Nous avons observé par des expériences d’immunofluorescence que l’endophiline A2 se localise principalement au niveau du cytosol alors qu’EFA6 se trouve à la membrane 92 plasmique au niveau de replis membranaires. Lorsque ces deux protéines sont cotransfectées, on observe que l’endophiline A2 se relocalise en partie à la membrane plasmique dans des structures riches en EFA6. Nous nous sommes intéressés à l’internalisation du récepteur à la transferrine. En effet, des études précédentes menées au laboratoire avaient mis en évidence que la surexpression d’EFA6 inhibait l’internalisation de la transferrine et induisait la redistribution de son récepteur à la surface par un mécanisme inconnu. Dans cette étude, nous avons confirmé cet effet d’EFA6 et avons observé que la surexpression de l’endophiline A2 n’avait aucun effet sur l’internalisation de la transferrine. En revanche, nous observons dans les cellules surexprimant l’endophiline et EFA6, que l’internalisation de la transferrine se fait de manière similaire aux cellules contrôles et aux cellules surexprimant l’endophiline A2 seule. Ceci montre que la surexpression d’endophiline est capable de lever l’effet inhibiteur de la surexpression d’EFA6 sur l’internalisation de la transferrine. De plus, ces résultats indiquent que l’endophiline et EFA6 agissent sur la même voie pour contrôler l’internalisation de la transferrine. Pour expliquer ces résultats nous avons retenus l’hypothèse qu’EFA6 surexprimé piégerait l’endophiline endogène l’empêchant ainsi d’assurer ses fonctions dans l’endocytose et qu’une surexpression complémentaire de l’endophiline est nécessaire pour réverser cet effet. IV. Résultats complémentaires Dans le but d’approfondir les résultats obtenus sur l’effet stimulateur de l’endophiline A1 sur l’activité d’EFA6, nous avons réalisé des expériences complémentaires. Nous avons donc étudié l’effet de concentrations croissantes d’endophiline A1 sur la cinétique d’échange nucléotidique d’Arf6 catalysée par EFA6. Nous observons que plus la concentration d’endophiline A1 dans le milieu est importante, plus la liaison d’Arf6 au GTPγS est élevée. L’endophiline augmente l’activité d’échange d’EFA6 sur Arf6 de manière dépendante de la dose (Figure 34). Au cours de cette étude nous avons également cherché à déterminer si l’interaction du domaine Sec7 d’EFA6 avec le domaine N-BAR est spécifique de l’endophiline. Pour cela, nous avons réalisé une expérience de pull-down avec le domaine Sec7 d’EFA6 et différentes protéines possédant des domaines N-BAR dont l’amphyphysine, l’Arfaptine et l’endophiline 93 en contrôle. Nous avons pu observer que ni l’amphiphysine, ni l’Arfaptine n’interagissaient directement avec le domaine Sec7 d’EFA6. Ces résultats suggèrent que la structure 3D n’est pas suffisante et que la séquence primaire du domaine BAR est importante pour la liaison à EFA6 (Figure article S2). Nous nous sommes également intéressés au rôle de cette interaction sur l’internalisation d’autres récepteurs et notamment le récepteur 2-adrénergique. Nous savons que la fixation du ligand induit l’internalisation du RCPG activé. Afin de déterminer si l’endophiline et EFA6 ont un rôle sur cette internalisation, nous avons effectué des expériences d’immunofluorescence sur des cellules HEK exprimant stablement le récepteur β2- adrénergique couplé à la GFP et transfectées avec l’endophiline A2 seule ou avec EFA6. Suite à l’addition d’isoprotérenol, nous observons une internalisation du récepteur. Le récepteur s’accumule dans des vésicules à l’intérieur des cellules. Cette internalisation est dépendante du temps d’incubation avec le ligand. Nous pouvons observer que plus la durée d’incubation avec le ligand est longue, plus le récepteur se retrouve à l’intérieur des cellules. Nous n’observons aucune différence significative sur l’internalisation du récepteur β2- adrénergique quand l’endophiline A2 est transfectée seule ou avec EFA6 (Figure 35). Cette expérience ne nous permet donc pas de conclure quant au rôle de ces deux protéines et de leur interaction sur l’internalisation de ce récepteur, mais suggère que la quantité de ces deux protéines n’est pas limitante car leur surexpression n’accélère pas le processus d’internalisation. Dans le but de répondre à cette question, il serait intéressant d’éteindre l’expression de ces deux protéines dans les cellules à l’aide de siRNA. Cependant l’existence de plusieurs isoformes de ces deux protéines complique l’interprétation de ces expériences. Des expériences menées au laboratoire ont montré que dans des cellules HEK transfectées stablement avec le récepteur β2-adrénergique couplé à la GFP et cultivées dans un milieu avec sérum, EFA6 était capable de redistribuer le récepteur à l’intérieur des cellules. Des expériences plus approfondies menées au laboratoire suggèrent que cet effet ne serait pas dû à une stimulation de l’internalisation mais à une inhibition du recyclage et serait dépendant de l’activation d’Arf6. Afin de visualiser la redistribution du récepteur β2 adrénergique induite par EFA6 et de déterminer si l’expression de l’endophiline affectait cet effet, nous avons réalisé des expériences d’immunofluorecence sur les cellules HEK exprimant stablement le récepteur β2-adrénergique et transfectées avec EFA6 et/ou l’endophiline A2. Nous observons dans les cellules surexprimant EFA6 et cultivées dans un 94 milieu sans sérum, que le récepteur β2-adrénergique se localise majoritairement à la membrane plasmique (Figure 36, panneau gauche). Cependant, lorsque ces cellules surexprimant EFA6 sont cultivées en présence de sérum, nous constatons une forte redistribution du récepteur à l’intérieur des cellules (Figure 36, panneau droite). En revanche, l’endophiline A2 ne semble pas avoir d’effet sur la localisation du récepteur que l’on soit en présence ou en absence de sérum. Cet effet du sérum dépend de la présence d’EFA6 car en absence d’EFA6 le récepteur se retrouve principalement à la membrane plasmique. Nous observons aussi que l’expression de l’endophiline A2 n’inhibe pas la redistribution du récepteur induite par l’expression d’EFA6 en présence de sérum. Ces résultats nous montrent qu’EFA6 est capable de redistribuer le récepteur en présence de sérum et que cette redistribution n’est pas affectée par la sur-expression d’endophiline. L’endophiline ne semble donc pas jouer un rôle dans le mécanisme de recyclage du récepteur 2-adrénergique stimulé ou non.

Résultats complémentaires

Dans le but d’approfondir les résultats obtenus sur l’effet stimulateur de l’endophiline A1 sur l’activité d’EFA6, nous avons réalisé des expériences complémentaires. Nous avons donc étudié l’effet de concentrations croissantes d’endophiline A1 sur la cinétique d’échange nucléotidique d’Arf6 catalysée par EFA6. Nous observons que plus la concentration d’endophiline A1 dans le milieu est importante, plus la liaison d’Arf6 au GTPγS est élevée. L’endophiline augmente l’activité d’échange d’EFA6 sur Arf6 de manière dépendante de la dose (Figure 34). Au cours de cette étude nous avons également cherché à déterminer si l’interaction du domaine Sec7 d’EFA6 avec le domaine N-BAR est spécifique de l’endophiline. Pour cela, nous avons réalisé une expérience de pull-down avec le domaine Sec7 d’EFA6 et différentes protéines possédant des domaines N-BAR dont l’amphyphysine, l’Arfaptine et l’endophiline 93 en contrôle. Nous avons pu observer que ni l’amphiphysine, ni l’Arfaptine n’interagissaient directement avec le domaine Sec7 d’EFA6. Ces résultats suggèrent que la structure 3D n’est pas suffisante et que la séquence primaire du domaine BAR est importante pour la liaison à EFA6 (Figure article S2). Nous nous sommes également intéressés au rôle de cette interaction sur l’internalisation d’autres récepteurs et notamment le récepteur 2-adrénergique. Nous savons que la fixation du ligand induit l’internalisation du RCPG activé. Afin de déterminer si l’endophiline et EFA6 ont un rôle sur cette internalisation, nous avons effectué des expériences d’immunofluorescence sur des cellules HEK exprimant stablement le récepteur β2- adrénergique couplé à la GFP et transfectées avec l’endophiline A2 seule ou avec EFA6. Suite à l’addition d’isoprotérenol, nous observons une internalisation du récepteur. Le récepteur s’accumule dans des vésicules à l’intérieur des cellules. Cette internalisation est dépendante du temps d’incubation avec le ligand. Nous pouvons observer que plus la durée d’incubation avec le ligand est longue, plus le récepteur se retrouve à l’intérieur des cellules. Nous n’observons aucune différence significative sur l’internalisation du récepteur β2- adrénergique quand l’endophiline A2 est transfectée seule ou avec EFA6 (Figure 35). Cette expérience ne nous permet donc pas de conclure quant au rôle de ces deux protéines et de leur interaction sur l’internalisation de ce récepteur, mais suggère que la quantité de ces deux protéines n’est pas limitante car leur surexpression n’accélère pas le processus d’internalisation. Dans le but de répondre à cette question, il serait intéressant d’éteindre l’expression de ces deux protéines dans les cellules à l’aide de siRNA. Cependant l’existence de plusieurs isoformes de ces deux protéines complique l’interprétation de ces expériences. Des expériences menées au laboratoire ont montré que dans des cellules HEK transfectées stablement avec le récepteur β2-adrénergique couplé à la GFP et cultivées dans un milieu avec sérum, EFA6 était capable de redistribuer le récepteur à l’intérieur des cellules. Des expériences plus approfondies menées au laboratoire suggèrent que cet effet ne serait pas dû à une stimulation de l’internalisation mais à une inhibition du recyclage et serait dépendant de l’activation d’Arf6. Afin de visualiser la redistribution du récepteur β2 adrénergique induite par EFA6 et de déterminer si l’expression de l’endophiline affectait cet effet, nous avons réalisé des expériences d’immunofluorecence sur les cellules HEK exprimant stablement le récepteur β2-adrénergique et transfectées avec EFA6 et/ou l’endophiline A2. Nous observons dans les cellules surexprimant EFA6 et cultivées dans un 94 milieu sans sérum, que le récepteur β2-adrénergique se localise majoritairement à la membrane plasmique (Figure 36, panneau gauche). Cependant, lorsque ces cellules surexprimant EFA6 sont cultivées en présence de sérum, nous constatons une forte redistribution du récepteur à l’intérieur des cellules (Figure 36, panneau droite). En revanche, l’endophiline A2 ne semble pas avoir d’effet sur la localisation du récepteur que l’on soit en présence ou en absence de sérum. Cet effet du sérum dépend de la présence d’EFA6 car en absence d’EFA6 le récepteur se retrouve principalement à la membrane plasmique. Nous observons aussi que l’expression de l’endophiline A2 n’inhibe pas la redistribution du récepteur induite par l’expression d’EFA6 en présence de sérum. Ces résultats nous montrent qu’EFA6 est capable de redistribuer le récepteur en présence de sérum et que cette redistribution n’est pas affectée par la sur-expression d’endophiline. L’endophiline ne semble donc pas jouer un rôle dans le mécanisme de recyclage du récepteur 2-adrénergique stimulé ou non. Nous nous sommes aussi intéressés à la dynamique des puits d’endocytose par la technique de TIR-FM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) autrement appelée microscopie à ondes évanescentes. Cette technique permet d’observer les protéines fluorescentes au voisinage de la membrane plasmique (à moins de 200nm). Elle est particulièrement adaptée pour visualiser les protéines présentes au niveau des puits et de déterminer leurs temps de résidence. Nous constatons ainsi que dans les cellules l’endophiline A2 a un marquage ponctiforme, suggérant une localisation au niveau des puits d’endocytose. Nous observons également que les points marqués par l’endophiline A2 sont dynamiques et ont une durée de vie d’une dizaine de secondes. En revanche nous remarquons qu’EFA6 possède un marquage diffus traduisant une localisation à la membrane plasmique comme décrit précédemment (Figure 37). Ces résultats mettent en évidence que l’endophiline A2 semblent être présente au niveau des puits d’endocytose alors qu’EFA6 n’y est pas concentrée