Etude de l’activite antidiarrheique de l’extrait RFA712 chez le cobaye

En raison de l’insalubrité, les peuples du tiers monde sont des sujets à plusieurs maladies communes, y compris la diarrhée. En 2010, seulement 42,63% de la population ont accès à l’eau potable et 47,97% à un assainissement de base adéquate. Les décès causés par la diarrhée proviennent surtout de l’insalubrité des aliments et de l’eau (HARI J.R. et LAKSHMINARAYANA M., 2012). Plusieurs facteurs concourent à la fréquence et à la gravité des diarrhées, la difficulté à l’accessibilité à l’eau potable, l’insuffisance alimentaire, le manque d’hygiène et la prévalence élevée des agents pathogènes. La cause la plus fréquente est l’infection gastro-intestinale par différents types de bactéries (choléra, Escherichia coli), virus (Rotavirus) et parasites. Cette infection peut se propager par la nourriture et l’eau. La diarrhée peut être due aussi à une intolérance alimentaire, une anxiété, un stress ou à une surcharge hydrique (AVRIL J.L. et coll., 1992).

La maladie diarrhéique constitue un problème majeur dans les pays en voie de développement malgré les énormes progrès de la médecine, où elle représente la deuxième cause de mortalité chez les moins de 5 ans (OMS, 1996 ; FARTHING M., LINDBERG G. et coll., 2008). Chaque jour, 6000 personnes meurent à cause des maladies diarrhéiques. En 1998 les maladies diarrhéiques ont tué près de 2,2 millions d’enfant dans le monde. Et plus de 1,5 millions d’enfants en meurent chaque année (WHO, 1999).

De 1984 à 1995 dans la capitale 28% des enfants de 1 à 15 ans sont morts à la suite d’une maladie diarrhéique. En 1999, à Madagascar, le taux de mortalité infanto-juvénile était à 88 pour 1000. En 2008, la diarrhée constitue la 2ème cause principale de consultation dans les centres de santé et 22% des décès des enfants étaient dus à des maladies liées à la diarrhée (OMS, 2012). La prévalence de la diarrhée varie d’un minimum de 2 % dans la région de Vakinankaratra à un maximum de 18 % dans la région de Boeny. A Analamanga, elle est de 10% (ANDRIANJAKA J.C. et RAKOTONDRABE F.P., 2011).

Dans les pays industrialisés, le nombre de décès par diarrhée est relativement faible, mais elle continue cependant à être une importante cause de morbidité et induit des coûts substantiels en matière de soins (FARTHING M., LINDBERG G. et coll., 2008).

La diarrhée est caractérisée par une émission excessive et fréquente de matières fécales liquides ou molles due à une perturbation des échanges hydriques dans l’intestin, et à une augmentation du péristaltisme, entrainant une perte d’eau et d’électrolytes dans les selles. C’est un signe de dérèglement physiologique au niveau du tube digestif (KID A., 1990) .

Elle est généralement accompagnée de douleur et de crampes intestinales qui peuvent rendre le sujet mal à l’aise, ainsi que des frissons et de sueurs froides (OMS, 1989).

L’intestin grêle est le siège de deux phénomènes : la première c’est l’absorption ou le transfert d’eau, des électrolytes et des molécules, dans l’intestin vers le sang, nécessaires pour la croissance et la réparation du corps par l’intermédiaire des villosités intestinales, et le second le transfert de l’eau et des électrolytes du sang vers l’intestin ou la sécrétion par la crypte de l’épithélium intestinale. En plus de la digestion des aliments et de l’absorption des nutriments, l’intestin joue un rôle majeur dans le maintien de l’équilibre hydro-électrolytique de l’organisme humain. Il contient de l’eau provenant des aliments et des sécrétions cellulaires de la muqueuse digestive c’est-à-dire de la salive, du suc gastrique, de la bile, du suc pancréatique et de l’intestin. À l’état normal, l’absorption d’eau et d’électrolytes prédomine celle de leur sécrétion, dans le cas contraire, la diarrhée apparait à cause de la domination du phénomène sécrétoire qui entraîne une fuite d’eau et d’électrolytes dans les selles (BENBERNOU L., 2000).

Selon la durée de la diarrhée, elle peut être classée en diarrhée aigüe et diarrhée chronique. La diarrhée aigüe est caractérisée par un début brutal et une durée limitée, elle est souvent causée par des entérotoxines produits par des bactéries. Dans ce cas, les mécanismes cellulaires de la diarrhée sont différents suivant les microorganismes en cause : des bactéries entérotoxinogènes ou entéropathogènes. Les bactéries entérotoxinogènes sont non invasives, comme le Vibrio cholerae et l’Escherichia coli entérotoxinogènes, elles colonisent la muqueuse de l’intestin grêle grâce à des facteurs d’attachement. Elles élaborent des toxines qui se fixent spécifiquement sur les cellules de la muqueuse et stimulent l’hypersécrétion d’eau et d’électrolytes. La diarrhée est essentiellement aqueuse, sans leucocytes ni mucus. (CATHERINE D., 1997). Par contre, les bactéries enteropathogènes sont des germes invasifs, elles pénètrent dans la muqueuse intestinale du côlon et parfois de l’iléon terminal et se multiplient, entraînant la destruction des entérocytes. La prolifération de ces bactéries entraine une destruction des entérocytes et provoque des lésions de la muqueuse. Les germes les plus courants sont les Shigelles, les Salmonelles et certaines souches d’Escherichia coli (DUPONT H.L.et LAJOUS C.I., 1994).

Préparation de l’extrait RFA712 

Les feuilles de la plante appartenant à la famille des LAUREACEAE ont été récoltées dans le District Atsimondrano, région Analamanga le mois de Novembre 2015. Elles ont été séchées à l’ombre dans une salle aérée pendant un mois, à la température ambiante, puis broyées à l’aide d’un broyeur électrique. Cinq cent grammes de cette poudre ont été macérés dans un mélange éthanol-eau (60 : 40) pendant trois jours à la température ambiante. Le macérât a été filtré avec du papier Whatman, et le filtrat obtenu a été évaporé sous vide à la température de 80°C à l’aide d’un évaporateur rotatif Evapotec®. L’extrait sec a été codé RFA712 puis pesé pour calculer le rendement de l’extraction suivant la formule :

【 Rendement = poids de l’extrait / poids de la poudre × 100 】

Criblage phytochimique

Afin de déterminer les grandes familles chimiques présentes dans l’extrait, un criblage phytochimique a été effectué à l’aide des réactifs spécifiques (FONG H.H.S.et coll., 1977). La présence de chaque famille est caractérisée par l’apparition de précipité ou d’un changement de coloration en présence des réactifs correspondants .

Des tests in vivo et in vitro ont été effectués chez le cobaye pour étudier l’activité antidiarrhéique de l’extrait RFA712. Son effet anti sécrétoire a été étudié in vivo en utilisant la méthode d’ « enteropooling », tandis que son effet sur la motilité intestinale a été étudié avec des tests in vitro sur le duodénum isolé d’un cobaye contracté avec l’acétylcholine en absence et en présence de l’extrait.

Étude de l’effet de l’extrait RFA712 sur la diarrhée sécrétoire 

L’activité de l’extrait contre la diarrhée sécrétoire a été étudiée par sa capacité d’inhiber l’accumulation du fluide intestinale ou « enteropooling » provoquée par le sulfate de magnésium (DOHERTY N.S., 1981). Des cobayes des deux sexes pesant de 200 g à 300 g âgés de 3 à 5 mois ont été utilisés. Ils ont été mis à jeun 18 heures avant le test, mais ont eu un accès libre à l’eau. Ils ont été répartis en 3 lots: un lot témoin et deux lots traités respectivement avec l’extrait aux doses de 200 et de 400 mg/kg par voie orale, dans un volume de 10 ml/kg (DIEHL K. H. et coll., 2001). Quarante cinq minutes après l’administration de ces produits, 2 g/Kg de MgSO4, dissouts dans de l’eau distillée, ont été administrés chez tous les animaux par voie orale dans un volume de 2 ml par cobaye, pour provoquer l’ »enteropooling » (LAKSHMINARAYANA M. et coll., 2011).

Trente minutes après administration du MgSO4, les animaux ont été sacrifiés et une laparotomie a été pratiquée. Deux ligatures ont été effectuées, la première au niveau du pylore et la deuxième, au niveau du caecum. L’intestin entre ces deux nœuds a été prélevé, et son contenu a été recueilli dans un récipient gradué et son volume a été mesuré (MAMILAINORO L., 1996).

Étude de l’effet de l’extrait RFA712 sur la diarrhée motrice

Pour étudier l’activité de l’extrait RFA712 sur la diarrhée motrice, son effet sur la motilité intestinale provoquée par l’acétylcholine a été étudié in vitro sur le duodénum isolé de cobaye.

Préparation et montage de l’organe

Des cobayes des deux sexes âgés de 3 à 5 mois, pesant entre 150 et 250 g ont été utilisés. L’animal a été mis à jeun 18 h avant la manipulation, puis assommé et exsanguiné en coupant les deux carotides. Après une laparotomie médiane, le duodénum de cobaye près du pylore a été prélevé et placé dans une boîte de pétri contenant une solution de Tyrode maintenue à la température de 37°C, et dont la composition en mM est la suivante : NaCl 136,9 ; NaHCO3 11,9 ; KCl 2,7 ; MgCl2 1,1; CaCl2 1,8 ; NaH2PO4 0,4 ; glucose 1 et de l’eau distillée (PRASHANT B. et coll., 2012).

Les mésentères et les tissus adipeux ont été enlevés, puis un segment d’organe environ 1,5cm a été monté dans une cuve à organe isolé contenant 20 ml de solution Tyrode maintenue à 37°C et barboté avec de l’air. À l’aide d’un fil à coudre, une des deux extrémités de l’organe a été fixé au fond de la cuve et l’autre extrémité a été fixé au stylet enregistreur avec un contre poids de 1g.

L’organe a été laissé se stabiliser pendant 45 minutes dans le bain. Durant cette période, il a été rincé toutes les 15 minutes. Après la période d’équilibration, la capacité contractile de l’organe a été testée avec de l’acétylcholine à la concentration de 10⁻⁵ M dans le bain.

Étude de l’effet de RFA712 sur la contraction provoquée par l’acétylcholine

Après la sensibilisation, l’organe a été rincé et laissé se stabiliser pendant 45 mn. Pendant la période d’équilibration, il a été rincé toutes les 15 minutes. Après cette période, l’acétylcholine a été injectée dans le bain d’une manière cumulative pour obtenir des concentrations croissantes à partir de 10⁻⁸ M dans le bain jusqu’à l’obtention de la contraction maximale. Au plateau de contraction, considéré comme effet maximal, l’extrait RFA712 a été injecté dans le bain d’une manière cumulative, à partir de 0,125 mg/ml jusqu’au relâchement total de l’organe contracté par l’acétylcholine.

L’amplitude des contractions a été mesurée et rapportée sur une échelle semi logarithmique, l’effet maximal de l’acétylcholine et la CE₅₀ de l’extrait ont été déterminés graphiquement.

près cette manipulation, la préparation a été rincée deux fois et laissée de nouveau se stabiliser pendant 45 minutes.

Etude de l’effet de RFA712vis-à-vis de l’effet contracturant l’acétylcholine

Pour étudier l’effet de RFA712 vis-à-vis de l’acétylcholine, l’organe a été incubé dans le bain contenant l’extrait aux concentrations respectives de 0,125 mg/ml et 0,25 mg/ml dans le bain pendant 15 minutes. Après 15 minutes de contact, l’acétylcholine a été injectée de nouveau de façon cumulative dans le bain pour réaliser des concentrations croissantes à partir de 10⁻⁸ M dans le bain jusqu’à l’obtention de la contraction maximale. L’amplitude de chaque contraction a été mesurée et rapportée sur une échelle semi logarithmique, l’effet maximal de l’acétylcholine, ainsi que ses CE₅₀ en absence et en présence de l’extrait ont été déterminés graphiquement.