Étude de la variabilité moléculaire inter-cellules dans le processus de différenciation érythrocytaire

Télécharger le fichier original (Mémoire de fin d’études)

La SEG et les processus de diﬀérenciation

L’hématopoïèse, un processus de diﬀérenciation multi-lignage

Le système sanguin contient plus de 10 diﬀérents types cellulaires avec des fonctions variées comme par exemple les leucocytes qui sont impliqués dans l’immunité acquise et innée ou encore les érythrocytes qui transportent l’oxygène dans l’organisme entier. Toutes ces cellules dérivent de cellules souches hématopoïétiques (CSHs) dont la niche se trouve dans la moelle osseuse. Avant de produire des cellules matures, les CSHs sont également capable de générer d’autres CSHs par divisions cellulaires. C’est ce que l’on appelle la capacité d’auto-renouvellement [218, 180].
La capacité de produire tous les lignages hématopoïétiques a été découverte autours des années 1950 en injectant de la moelle osseuse dans des souris irradiées permettant ainsi leur survie [53, 86]. Quelques années plus tard, des chercheur.e.s ont injecté un nombre plus restreint de cellules de la moelle dans des souris irradiées, et ont observé des colonies de cellules prolifératives dans la rate [201]. A partir de ce moment, des caractéristiques précises ont été imputées aux cellules hématopoïétiques. Ces cellules sont capables d’auto-renouvellement, de produire tous les lignages sanguins en passant par un enrichissement en progéniteurs multipotents [73]. Ces progéniteurs vont pouvoir former des colonies à partir de cellules uniques permettant les expériences sur des clones cellulaires. A ce stade, il est important de noter que les expériences de transplantations de CSHs in vivo ont été déterminantes pour identifier les capacités de diﬀérenciation dans tous les lignages sanguins et celles d’auto-renouvellement de ces cellules [162]. Nous avons pu voir alors apparaître des schémas d’hématopoïèse que j’appellerai les modèles classiques d’hématopoïèse où les CSHs s’engagent dans des lignages en passant par une série d’étapes discrètes, les décisions se faisant sur les points de ramification de cet arbre de diﬀérenciation (Figure 1.4 A et B). Dans ces modèles, chaque étape est marquée par un type cellulaire stable précédant un point de ramification. L’hypothèse la plus forte de ce modèle est l’homogénéité des types cellulaires intermédiaires. De 1980 à aujourd’hui encore, de nombreux modèles déterministes se succèdent, tous composés d’étapes discrètes où seuls les points de ramification évoluent [21, 191, 97, 69].
(A) Modèle classique de l’hématopoïèse. Les CSHs s’engagent dans des lignages en passant par des étapes discrètes. Ces étapes sont caractérisées par des types cellu-laires bien définis. Les événements décisionnels sont binaires et ont lieu à chaque point de ramification [107, 180]. (B) Modèle d’engagement des CSHs plus récent. Ici, les séparations en diﬀérents lignages se font plus précocement comparé au modèle pré-cédent [149, 154]. (C) Modèle continu suivant le concept du paysage épigénétique de Waddington. Les CSHs acquièrent progressivement des caractéristiques de lignages de manière continue. Dans ce modèle, les étapes en aval des CSHs comme MPPs ou CMPs ne représentent pas des étapes discrètes mais sont considérées comme des états de transition du processus de diﬀérenciation [123, 157, 208]. Source d’image : [73]. Légende : HSC = cellule souche hématopoïétique ; MPP = progéniteur multi-potents ; CMP = progéniteur commun myéloïde ; LMPP = progéniteur multipotent lymphocytaire ; MEP = progeniteur megacaryocyte et erythrocyte ; GMP = progé-niteur macrophage et Granulocytes ; CLP = progéniteur commun lymphoïde ; MkP = progéniteur mégacaryocyte ; EP = progéniteur érythrocyte ; GP = progéniteur granulocyte ; MP = progéniteur monocyte ; DP = progéniteur cellule dendritique ; Mk = megacaryocyte ; RGC = érythrocyte ; Granu = granulocyte ; Mano/mac = Monocyte/Macrophages ; DC = cellule dendritique ; NK = lymphocyte NK ; B = lymphocyte B ; T = lymphocyte T.
Les approches menant à ce genre de modèles s’appuient toutes sur le fait que tous les types cellulaires sont homogènes, masquant ainsi leur hétérogénéité intercellulaire. Cependant, des diﬀé-rences avaient déjà été remarquées dans ces expériences de transplantations de CSHs, notamment la durée pendant laquelle les CSHs transplantées sont capables de produire toutes les cellules sanguines matures. Plus tard, c’est l’identification de marqueurs de surface par cytométrie en flux qui amènera à une catégorisation des CSHs en 3 classes : les CSHs à longue durée, les CSHs à courte durée et les progéniteurs multipotents [101, 180]. Ces frontières nettes basées sur des caractéristiques morphologiques, choisies arbitrairement pour faciliter la compartimentalisation, a permis de contribuer au concept de population homogène. Plus récemment, les expériences de transplantation en cellules uniques ont permis de révéler une variabilité non négligeable dans les cinétiques de reconstitution des lignages et dans le potentiel d’auto-renouvellement des CSHs [45, 139, 140].
Ces avancées récentes ont donc permis de revoir les modèles classiques d’hématopoïèse au profit de modèles non déterministes et continus (Figure 1.4 C) [157, 123, 208, 138]. Ces modèles ne présentent plus la progression dans le processus de diﬀérenciation étape par étape, mais via un processus continu représenté par des vallées et des creux partant d’un sommet de montagne (les CSHs) jusqu’en bas de la montagne (cellules diﬀérenciées). Cette nouvelle vision moderne utilise le concept de paysage épigénétique de Conrad Waddington [213]. Il intègre l’hétérogénéité non génétique des cellules. Ici, la SEG est le support de la sélection naturelle et le destin cellulaire est vu comme un vecteur de probabilités [79, 116, 11]. Dans cette vision, une cellule est représentée par une bille et surplombe le sommet d’une montagne, qui représente le paysage épigénétique. La bille va tomber dans le paysage en suivant des chemins ramifiés. Chaque ramification est un symbole des événements décisionnels. Selon Conrad Waddington, la forme du paysage épigénétique dépend des mécanismes de régulation génétique sous-jacents au processus. Plus la bille descend, plus il est diﬃcile pour elle de changer de chemin ou de revenir en arrière 4.

Des processus de diﬀérenciation mono-lignage

Nous avons à présent une vision globale de l’hématopoïèse et du potentiel rôle de la SEG dans les processus de diﬀérenciation. Afin de mieux comprendre mes travaux, je décrirai dans les prochains paragraphes le processus de diﬀérenciation érythropoïétique puis la diﬀérenciation musculaire pour terminer avec des altérations du processus de diﬀérenciation comme certains cancers et notamment le cas de la leucémie myéloïde chronique.

La diﬀérenciation érythropoïétique

L’un des lignages possibles pour les CSHs est le lignage érythrocytaire. Le rôle des érythro-cytes est essentiel : ils sont chargés du transport de l’oxygène et du gaz carbonique à travers l’organisme. Ils sont également responsables de la régulation du pH sanguin et du transport de complexes immuns (complexes nécessaires à l’immunité humorale). La durée de vie de ces cellules chez l’homme est d’environ 120 jours [74]. Pour maintenir un taux constant de globules rouges dans le sang, leur production doit ainsi être très contrôlée. C’est l’hormone érythropoïétine (Epo) qui régule l’érythropoïèse [115]. Dans des conditions d’hypoxie, les cellules rénales vont produire et sécréter de l’Epo [87]. Cette hormone va alors être captée par les BFU-E (burst-forming unit – erythroid, progéniteurs immatures qui donnent des colonies éclatées) qui possèdent le récep-teur à l’Epo [89]. L’Epo va permettre la survie de ces cellules, les protégeant de l’apoptose. Ces cellules vont pouvoir ainsi se multiplier et devenir progressivement des CFU-E (colony-forming unit – erythroid, progéniteurs plus matures qui donnent naissance à de petites colonies). Ces der-nières cellules expriment très fortement le récepteur à l’Epo. La diﬀérenciation se poursuit ensuite progressivement jusqu’à la production d’érythrocytes [89, 5]. Ce processus se caractérise par une diminution de la taille des cellules [41] et une expulsion du noyau chez les mammifères, tandis que chez les oiseaux, les cellules gardent leur noyau. Dans ce dernier cas, le noyau se condense assez, empêchant ainsi les gènes de s’exprimer, de la même façon que si le noyau avait été expulsé [110]. Ce processus s’accompagne également d’un changement de niveau d’expression de gènes clés : une diminution de l’expression de gènes connus pour être impliqués dans le maintien en auto-renouvellement des progéniteurs comme le gène sca-2 [18] et une augmentation de l’expression des gènes codant par exemple pour les chaînes de l’hémoglobine, tels que la betaglobin [6]. C’est l’hémoglobine qui va permettre aux globules rouges d’assurer le transport des molécules d’oxygène à travers l’organisme. Une fois mature, ces cellules conservent très peu d’organites. Dans notre équipe, nous étudions depuis longtemps la diﬀérenciation érythrocytaire dans le modèle aviaire [60, 58, 56]. C’est un modèle historique pour l’étude du développement hématopoïétique, il a no-tamment permis la découverte des lymphocytes B, de l’ontogénie des lymphocytes T, du thymus et l’embryon de poulet a également permis de répondre à la question sur l’origine des cellules souches hématopoïétiques [88]. Pour l’étude de l’érythopoïèse, nous utilisons des T2EC (pour TGF-β/TGF-α-induced erythrocytic cells ) qui sont des progéniteurs érythrocytaires provenant de la moelle osseuse d’embryons de poulet. Par une combinaison de facteurs de croissance, les progé-niteurs érythrocytaires vont proliférer tandis que les autres cellules de la moelle osseuse finissent pas mourir [57]. Quelques jours plus tard, la culture est composé quasiment uniquement de T2EC qui vont être maintenus dans un état d’auto-renouvellement pendant environ 30 jours dans ce même milieu. D’autre part, ces cellules peuvent être induites à se diﬀérencier en remplaçant les facteurs de croissance du milieu par de l’insuline et du sérum de poulet anémié (contenant les produits nécessaire à l’activation de la diﬀérenciation) [57, 40, 168]. Ces cellules sont un excellent modèle de diﬀérenciation normale. Elles sont homogènes (<1% de cellules non érythrocytaires) et la diﬀérenciation spontanée est quasi inexistante dans cette population de cellules [57, 68].

La diﬀérenciation musculaire

Une autre forme de diﬀérenciation aussi bien décrite dans la littérature est la diﬀérencia-tion musculaire. Il existe dans l’organisme trois types musculaires : le muscle lisse, le muscle strié cardiaque et le muscle strié squelettique. Tous ces types musculaires sont constitués de myofibres, unité cellulaire du muscle. Notre nous intéresserons plus particulièrement aux muscles squelettiques. Ces muscles sont impliqués dans de nombreux processus en plus de la motricité di-rectement contrôlée par le système nerveux volontaire. La thermogénèse (production de chaleur) et le stockage d’énergie (réserve de glycogène) font également appel aux muscles striés squelet-tiques. Depuis 2013, nous savons également que ce muscle joue un rôle d’organe endocrinien par sécrétion de « myokines » [160].
La diﬀérenciation musculaire part de myoblastes, cellules encore immatures qui vont être capables de proliférer, se diﬀérencier et fusionner pour donner progressivement des myotubes multinucléés. En s’assemblant, ces myotubes donnent les fibres musculaires (myofibres) qui vont composer les faisceaux des muscles squelettiques [27, 90].
Le processus de diﬀérenciation est caractérisé par des marqueurs moléculaires couramment utilisés pour mesurer le degré de maturation des cellules. Par exemple, MYOD (myogenic diﬀe-rentiation 1 ) est un facteur de transcription régulateur de la myogénèse, et le premier de cette catégorie à avoir été découvert en 1987 par l’équipe de Robert L.Davis [39]. Son expression aug-mente précocement pendant le processus de diﬀérenciation musculaire de la même manière que MYOG (myogenin) [217], un autre facteur de transcription de cette famille. Il existe également d’autres facteurs de diﬀérenciation plus tardifs tels que MHC (Myosin heavy chain) dont l’expres-sion augmente après quelques jours suivant l’induction en diﬀérenciation [158]. C’est un gène qui code pour une des chaînes qui composent la Myosine (protéine de transport responsable de la contraction).
Dans notre étude sur le rôle de la SEG dans la myogénèse, nous avons utilisé des lignées de myoblastes murins, les C2C12 qui peuvent se diﬀérencier in vitro et former des myotubes [225, 25, 2]. Ces cellules, privées de sérum (ou avec une faible proportion de sérum dans le milieu) et à une certaine confluence, peuvent fusionner et à se diﬀérencier en cellules musculaires contractiles [2]. Après 4 jours, des myotubes se forment et quelques jours plus tard, des myofibres sont observées [132].

Les pathologies associées au processus de diﬀérenciation

Les processus de diﬀérenciation comme d’autres processus biologiques peuvent rencontrer des défauts et engendrer des pathologies telles que les cancers. Dans ce prochain paragraphe, je décrirai ce que nous connaissons du processus de cancérogénèse et je terminerai par un cas précis, la leucémie myéloïde chronique.

La cancérogénèse

Les études pour développer des thérapies eﬃcaces contre les cancers sont en constante évo-lution. Il y a quelques années, la recherche s’est focalisée sur quelques gènes considérés comme étant directement impliqués dans la cancérogénèse. Cependant, le nombre de cas de cancers monogénique reste faible. La pensée du rôle prépondérant des altérations génétiques dans les cancers s’est alors faite au détriment de tous les autres facteurs. Les théories sur l’origine des cancers ont été nombreuses à s’enchaîner. Plus récemment, il a été suggéré que l’origine de la mala-die serait une sous-population de cellules, appelées cellules souches cancéreuses [221, 209]. Ces cellules seraient capables à elles seules de développer une tumeur. De plus, la contribution de l’environnement des cellules vient également à être considéré plus sérieusement. Une théorie plus antérieure, celle de l’expansion clonale, décrit la tumorigénèse comme un processus d’évolution basé sur la sélection successive de cellules isolées possédant un avantage de croissance sur les cellules voisines [71]. Des événements épigénétiques seraient la force motrice de la cancérogénèse et amènerait certaines cellules à posséder des avantages sélectifs, qui par sélections successives, permettraient le développement d’un cancer. Diﬀérentes études ont en eﬀet montré l’implication de l’épigénétique dans les cancers. Par exemple, des gènes suppresseurs de tumeurs peuvent être hyperméthylés dans certains cancers, ce qui réduit leur expression [94, 51]. Le silencing de cer-tains de ces gènes comme le gène P 16 est également capable d’enclencher l’hyperméthylation de gènes essentiels pour la diﬀérenciation et la détermination du destin cellulaire, comme pour le gène HOXA9 dans les cellules épithéliales cancéreuses du sein [167]. Ces recherches amènent à penser que ces phénomènes de méthylation ou acétylation anormaux peuvent être en partie dus à un défaut dans l’expression de ces gènes, conséquence d’une perturbation de la machinerie de transcription ou des voies de signalisation.
Certaines perturbations peuvent provenir du micro-environnement qui a été montré comme étant essentiel à la progression tumorale. Des études suggèrent que la perturbation des interac-tions inter-cellules suﬃsent à conduire à une transformation maligne [124]. L’idée serait que les cellules sujettes à un environnement perturbé, seraient capables de se transformer et de dévelop-per des tumeurs. En eﬀet, si nous considérons les cellules comme des « agents adaptatifs », elles peuvent être capable de générer de la diversité intrinsèque pour ensuite être sélectionnées par leur environnement [112]. C’est le cas dans le processus de développement où la variabilité de l’expression des gènes va générer de la diversité phénotypique aux premiers stades embryonnaires pour permettre ensuite à l’environnement de sélectionner les cellules qui expriment la bonne combinaison de gènes et stabilise leur profil génétique [114]. Dans ce sens, les cellules qui s’engagent dans le processus de diﬀérenciation augmenteraient leur SEG (hypothèse indiquée ci-dessus) et les interactions cellulaires ainsi que le micro-environnement agiraient ensuite pour stabiliser leur nouveau phénotype [117]. Si on en revient aux cas des cancers, tous les facteurs pouvant pertur-ber ce micro-environnement seraient donc capables de déstabiliser les cellules. Cette vision est en accord avec de nombreux résultats suggérant l’importance de l’environnement cellulaire dans la tumorigénèse [175]. Toutes ces nouvelles connaissances nous suggèrent de percevoir le cancer non plus comme une altération mono-génique mais comme un déséquilibre global de l’environnement tissulaire. La recherche basée sur des façons de rééquilibrer cette homéostasie entre cellules et en-vironnement devient donc une stratégie thérapeutique plus sûre et plus eﬃcace que de seulement tuer en masse les cellules cancéreuses.

Le cas de la leucémie myéloïde chronique

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une pathologie identifiées dans les années 1960 due à un chromosome réarrangé appelé chromosome Philadelphie [145]. C’est une anomalie géné-tique acquise par les cellules souches anormales : elle n’est donc pas héréditaire. Le chromosome Philadelphie résulte de l’assemblage par erreur d’un gène du chromosome 9, dénommée ABL, avec un gène du chromosome 22, nommé BCR. Cela produit le gène dit BCR-ABL qui est présent uniquement dans les cellules de la maladie. Ce gène produit anormalement une enzyme possédant une activité tyrosine kinase, elle-même responsable du syndrome myéloprolifératif. Ce syndrome se caractérise par une production excessive et persistante au sein de la moelle osseuse des globules blancs, majoritairement restés immatures.
Les causes de l’apparition de ce chromosome restent inconnue mais il a toutefois été constaté une fréquence plus importante de la LMC parmi les survivants des bombardements atomiques d’Hiroshima et de Nagasaki. Les radiations ionisantes ont donc été suspectées comme pouvant provoquer la maladie, mais cela n’a jamais été formellement démontré. En suivant les concepts abordés précédemment, nous pouvons supposer que cette altération génétique pourrait provenir en partie d’un déséquilibre de l’environnement cellulaire, et plus précisément dans la moelle osseuse humaine [120].

Table des matières

1 Introduction
1.1 La stochasticité de l’expression des gènes (SEG)
1.1.1 L’histoire de la stochasticité biologique
1.1.2 Les sources de cette variabilité
1.1.3 Les techniques de mesure et d’analyse de la variabilité
1.1.3.1 La mesure de la variabilité au niveau protéique
1.1.3.2 La mesure de la variabilité au niveau transcriptomique
1.1.3.3 Les limites et biais de mesure de la variabilité
1.1.3.4 L’analyse de la variabilité
1.1.4 Les rôles connus dans les processus biologiques
1.2 La SEG et les processus de différenciation
1.2.1 L’hématopoïèse, un processus de différenciation multi-lignage
1.2.2 Des processus de différenciation mono-lignage
1.2.2.1 La différenciation érythropoïétique
1.2.2.2 La différenciation musculaire
1.2.3 Les pathologies associées au processus de différenciation
1.2.3.1 La cancérogénèse
1.2.3.2 Le cas de la leucémie myéloïde chronique
2 Étude de la variabilité moléculaire inter-cellules dans le processus de différenciation érythrocytaire
2.1 Introduction
2.2 Article
2.3 Données supplémentaires
2.4 Conclusions
3 Automatisation de la mesure du cycle et de la taille cellulaire pour l’analyse en cellule unique
3.1 Introduction
3.2 Article
3.3 Conclusions
4 Inférence de réseaux dynamiques de régulation de gènes par un algorithme itératif : WASABI
4.1 Introduction
4.2 Article
4.3 Conclusions
5 Calibration, sélection et analyses de l’identifiabilité d’un modèle mathématique de la différenciation érythrocytaire in vitro dans des conditions contrôles et perturbées
5.1 Introduction
5.2 Article
5.3 Conclusions
6 Effet des drogues qui modulent la stochasticité de l’expression des gènes sur le processus de différenciation érythrocytaire
6.1 Introduction
6.2 Article
6.3 Conclusions
7 Effet des drogues qui modulent la stochasticité de l’expression des gènes sur le processus de différenciation musculaire
7.1 Introduction
7.2 Matériel et méthodes
7.2.1 Culture cellulaire
7.2.2 Extraction d’ARN, rétro-transcription et PCR quantitative en temps-réel
7.2.3 Immunofluorescence (IF)
7.3 Principaux résultats
7.3.1 Effet de l’Artemisinin et de l’Indomethacin sur la myogénèse
7.3.2 Effet de MB-3 sur la myogénèse
7.4 Conclusions et perspectives
8 Étude des mécanismes de résistance à l’Imatinib dans le cadre de la leucémie myéloïde chronique par une approche en cellules uniques
8.1 Introduction
8.2 Matériel et méthodes
8.2.1 Culture cellulaire
8.2.2 RTqPCR haut débit en population et en cellules uniques
8.2.3 Analyses statistiques
8.3 Principaux résultats
8.3.1 Établissement d’une liste de gènes d’intérêts
8.3.2 Identification et caractérisation d’un modèle in vitro de cellules myéloïdes chroniques
8.3.3 Analyses préliminaires des données transcriptomiques en cellules uniques
8.4 Conclusions et perspectives
9 Discussion et perspectives
9.1 La rôle de la SEG dans la différenciation
9.2 Les mécanismes épigénétiques sous-jacents au contrôle du niveau de SEG
9.3 Contrôle de la différenciation dans le cadre des pathologies
Bibliographie