Lamiae
Sommaire: Etude de la structure des gels protéiques par Microscopie confocale
Introduction
I. Situation bibliographie
I.1. La bêta‐lactoglobuline (βlg) et les lipocalines
I.1.1. Définition
I.1.2. Structure moléculaire
I.1.3. Variant génétiques de la bêta‐lactoglobuline
I.2. Comportement de la bêta‐lactoglobuline à l’état natif
I.2.1. Influence du pH
I.2.2. Influence du sel
I.2.2.1. Salting‐in
I.2.2.2. Salting‐out
I.2.3. Influence de la concentration de βlg
I.3. Dénaturation de la bêta‐lactoglobuline
I.3.1. Dénaturation thermique de la bêta‐lactoglobuline
I.3.2. Influence du pH
I.3.3. Influence du sel
I.4. Agrégation et gélification de la βlg
I.4.1. Structure des agrégats dilués
I.4.2. Structure des gels
I.5. Gélification à froid
I.6. Résumé
II. Matériels et Méthodes
II.1. Méthode de caractérisation par Microscopie
II.1.1. Microscopie Confocale à balayage laser(MCBL)
II.1.1.1. Principe de fluorescence
II.1.1.2. Paramètres de fluorescence
II.1.1.3. Durée de vie ou photo stabilité
II.1.1.4. Présentation de la technique de Microscopie
II.1.1.5. Détecteur : PhotoMultiplicateur Tube (PMT)
II.1.2. Méthodes d’analyse quantitative
II.1.2.1. Sonde fluorescente
II.1.2.2. Etude de l’influence du gain (G)
II.1.2.3. Histogramme des images : mode de représentation
II.1.2.4. Mesure de la turbidité par MCBL
II.1.2.5. Fonction de corrélation de paire de pixels
II.1.2.6. Comparaison entre g(r) théorique et expérimental
II.1.2.7. Conclusion
II.1.3.Méthodes de caractérisation et de préparation des échantillons
II.1.3.1. Préparation de la bêta‐lactoglobuline en solution
II.1.3.2. Fluorescence de la rhodamine
II.1.3.3. Agrégation en présence de la rhodamine
II.1.3.4. « Précipitation » des gels de βlg.
II.1.3.5. Chauffage des systèmes : mode A
II.1.3.6. Caractérisation des gels
II.1.3.7. Obtention d’un g(r) complet
II.1.3.8. Interprétation du g(r)
II.1.3.9. Gélification en présence de la rhodamine
II.1.3.10. Méthode de « box counting »
II.1.3.11. Conclusion
II.2. Technique de diffusion du rayonnement
II.2.1. Diffusion statique du rayonnement
II.2.1.1. Principe de la diffusion
II.2.1.2. Diffusion statique de la lumière
II.2.1.3. Diffusion des rayons X aux petits angles : SAXS
II.2.2. Diffusion dynamique de la lumière
II.2.3. Diffusion statique de la lumière en milieu turbide (3DLS)
II.2.4. Caractéristiques des appareillages utilisés
II.2.4.1. Diffusion de la lumière classique
II.2.4.2. Diffusion de la lumière en milieu turbide
II.2.4.3. Diffusion des rayons X aux petits angles : SAXS
II.2.5. Turbidimétrie
II.2.5.1. Théorie de la turbidimétrie
II.2.5.2. Appareillage expérimental
III. RESULTATS ET DISCUSSIONS
III.1. Etude de la gélification à chaud de la bêta‐lactoglobuline
III.1.1. Introduction
III.1.2. Etude des systèmes à 100g/l de βlg
III.1.2.1. Etude en fonction de la force ionique à pH7
III.1.2.2. Etude de la structure des gels à 100g/l de βlg
III.1.3. Etude en fonction du pH sans sel
III.1.3.1. Evolution de la turbidité et de D/d en fonction du pH
III.1.3.2. Etude de la structure des gels sans sel à 100g/l
III.1.4.Etude en fonction de la concentration de βlg à 0.25M (NaCl) à pH7
III.1.4.1. Evolution de la turbidité et du rapport D/d
III.1.4.2. Evolution des g(r) pour différentes concentrations de βlg
III.1.4.3. Synérèse des gels en fonction de la concentration de βlg
III.1.4.4. Diagramme de phase
III.1.5. Résumé et conclusion
III.2.Etude de la gélification à froid des agrégats de la bêta‐lactoglobuline .
III.2.1.Comparaison entre la structure des gels à froid et des gels à chaud
III.2.1.1. Ressemblance
III.2.1.2. Différences
III.2.2. Structure des gels à froid
III.2.2.1. Influence de la température
III.2.2.2. Influence de la force ionique
III.2.2.3. Influence de la concentration des pré‐agrégats
III.2.2.4. Influence de la taille des pré‐agrégats
III.2.2.5. Evolution de la turbidité et du module élastique
III.2.2.6. Conclusion
Conlusion
Références Bibliographiques
Extrait du mémoire Etude de la structure des gels protéiques par Microscopie confocale
I. Situation bibliographie
Une protéine globulaire est une macromolécule composée par une chaîne d’acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques et possédant quatre niveaux de structures différents.
L’enchainement de ces acides aminés constitue la structure primaire. Les protéines comportent des zones ordonnées périodiquement où la chaîne polypeptidique linéaire présente une structure tridimensionnelle régulière de type hélice α ou feuillet β. Ces différentes régions, dont l’organisation est maintenue par des liaisons hydrogènes entre acides aminés, constituent la structure secondaire de la protéine. La structure tertiaire correspond à une organisation tridimensionnelle des éléments de la structure secondaire, et résulte d’interactions non-covalentes (hydrogènes, hydrophobes, Van der Waals, électrostatiques…) avec parfois des ponts disulfures. La structure quaternaire se définit par l’état d’oligomérisation de la protéine c’est-à-dire par l’association de plusieurs chaines. La protéine peut ainsi se présenter sous forme de monomères, de dimères…L’état « natif » d’une protéine correspond à la conformation prise à l’état naturel.
La structure des gels protéiques
I.1. La bêta-lactoglobuline (βlg) et les lipocalines
I.1.1. Définition
Les lipocalines constituent une grande famille de protéines caractérisée par une cavité centrale hydrophobe appelée barrique-β, qui leur donne la capacité de lier de petites molécules hydrophobes en les enfermant dans leur poche hydrophobe pour réduire au minimum le contact avec le solvant. Elles sont classées parmi les protéines de transport et sont impliqués dans plusieurs fonctions importantes, comme la modulation de la croissance et du métabolisme, l’olfaction, la biogenèse et la réparation des membranes, etc. C’est à cette famille de protéines qu’appartient la βlg (Oliveira, Valente-Mesquita, Botelho, Sawyer, Ferreira & Polikarpov, 2001).
La structure des gels protéiques
I.1.2. Structure moléculaire
La structure primaire de la βlg est constituée de 162 acides aminés et a, pour le variant A, une masse moléculaire de 18 362 Da. Elle est riche en acides aminés sulfatés, d’où sa grande valeur nutritionnelle. La conformation globulaire de la βlg est une conséquence de la répartition uniforme des résidus non-polaires, polaires et ionisés qui permet aux résidus hydrophobes de s’enfouir au sein de la molécule. La structure secondaire de la molécule a été déterminée par plusieurs techniques incluant le dichroïsme circulaire, la spectroscopie infrarouge et la cristallographie. Elle comporte 10-15% d’hélices α, 43-50% de feuillets β, et 15 à 20% de coudes β. Cette structure se présente sous forme de huit brins de feuillets-β antiparallèles (nommées A à H dans la Figure I.1) qui s’enroulent pour former un tonneau β antiparallèle en forme de cône aplati ou de calice, dont l’intérieur est hydrophobe.
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