Spectre d émission de fluorescence

Le principe de Franck-Condon s’applique aussi bien à l’absorption qu’à l’émission de fluorescence [15,18,19]. L’énergie de la radiation émise par une molécule excitée est inférieure à son énergie d’excitation, par conséquent le spectre d’émission de fluorescence est décalé vers les grandes longueurs d’ondes par rapport au spectre d’absorption (loi de Stockes). Une durée de vie de fluorescence trop longue et/ou une intensité de la bande d’émission dépendant de la température peuvent retarder la fluorescence normale. Ce phénomène est en général observé si après croisement intersystème S1 T1 très rapide, l’état S1 est de nouveau produit soit par annihilation TripletTriplet (T1+ T1 → S1+ S0) ,soit par activation thermique de T1 [20].

ETUDE DE LA FLUORESCENCE

Spectre d émission de fluorescence

Relation entre fluorescence et concentration

La puissance moyenne du rayonnement fluorescent F est proportionnelle à la puissance du faisceau d’excitation absorbée par le système : F=K ’ ( Po – P)
Où Po est la puissance du faisceau incident sur la solution et P est la puissance du faisceau qui a traversé une épaisseur l de solution. La constante K‘ dépend du rendement quantique de fluorescence. Pour relier F à c on écrit la loi de Beer – Lambert P/Po = 10 -εlc où ε l c = A est l’absorbance. En combinant les deux équations on obtient :
Le graphique de la puissance de fluorescence d’une solution en fonction de la concentration de l’espèce émettrice est donc linéaire aux faibles concentrations [10,19].
Si c devient assez grand pour que l’ absorbance soit supérieure à 0.05, la relation cesse d’être linéaire. Cet effet résulte de l‘auto désactivation, un phénomène où des molécules absorbent la fluorescence émise par d’autres.

Facteurs affectant la fluorescence

La fluorescence est un processus de désactivation radiative de l’état singulet S1, par conséquent son intensité dépendra des autres processus concurrents de désactivation de S1. décrits dans le diagramme de Jablonski.
Etant donné que :  le rendement quantique de fluorescence sera donc très sensible à des facteurs liés à la structure de la molécule, à sa rigidité, à des facteurs comme la température, le pH du milieu et la nature du solvant utilisé.

Fluorescence et Structure

Les composés qui contiennent des noyaux aromatiques produisent une émission de fluorescence moléculaire très intense. Certains composés carbonylés aliphatiques et acycliques, ainsi que systèmes à doubles liaisons conjuguées sont aussi fluorescents, cependant ils sont beaucoup moins nombreux que les premiers.
La plupart des hydrocarbures non substitués sont fluorescents en solution et le rendement quantique de fluorescence augmente avec le nombre de cycle et leur degré de condensation.
Exemple : Les hétérocycles les plus simples tels que la pyridine, le torpène et le furan ne présentent pas de fluorescence moléculaire alors que les structures à cycles accolés contenant ces hétérocycles le sont souvent.

Fluorescence et rigidité

On a constaté que la fluorescence est particulièrement intense si la molécule est rigide. Par exemple dans des conditions de mesure similaire, le rendement quantique de fuorène est proche de l’unité alors que celui du biphényl n’est qu’environ 0.2. Cette différence est due l’augmentation de la rigidité qui résulte de pontage par le groupe méthylène dans le fuorène. Cette rigidité diminue le temps de relaxation non rayonnante au point que la relaxation par fluorescence a le temps de se produire.

Effet de la Température et du solvant

Dans la plupart des cas, le rendement quantique de fluorescence diminue lorsque la température augmente car l’accroissement de la fréquence de collisions aux températures élevées augmente la probabilité qu’il y ait relaxation par collision. La diminution de viscosité du solvant conduit au même résultat. Le pH du milieu influe sur l’intensité de fluorescence. Il est donc nécessaire de tenir compte de tous ces facteurs avant toute étude analytique [6,11,17].

Méthodes de dérivatisation

Elles permettent de surmonter des problèmes liés à un faible rendement quantique de fluorescence du produit à étudier.

Espèces non fluorescentes

La fluorescence est l’un des mécanismes par lequel une molécule revient à son état fondamental après avoir été excitée par l’absorption d’un rayonnement. On pourrait penser dès lors que toutes les molécules absorbantes doivent être fluorescentes, ce qui n’est pas le cas.
La plupart ne le sont pas car leur structure est telle que la relaxation non rayonnante peut se produire plus rapidement que l’émission fluorescente.
Cependant, il est possible de transformer une molécule non fluorescente en un dérivé fluorescent par des méthodes de prétraitement spécial (thermodynamique, chimique, photochimiques) [6,7]. Dans le cas des amines le dérivé fluorescent formé est obtenu par voie chimique avec généralement des sensibilisateurs comme le Chlorure de NBD, l’OPA, la fluorescamine ou le chlorure de Dansyl.

Problèmes d’interférences

Pour contourner certains problèmes liés à l’interférence entre le produit à étudier et d’autres produits présents dans le milieu d’étude, il est possible de transformer (par réaction chimique) le produit à étudier en un dérivé fluorescent émettant dans une zone éloignée de la zone d’interférence.

Le Marquage fluorogénique

C’est la méthode de dérivatisation la plus utilisée de nos jours probablement à cause de sa très grande sensibilité, laquelle varie du reste avec la nature du marqueur fluorogénique [6]. Cette technique consiste à greffer par exemple sur l’analyte (substance non fluorescente à analyser) une molécule connue pour ses propriétés fluorogénique par réaction chimique ou par un traitement physique spécial (thermique, électrique, ..).

Marquage avec le Chlorure de NDB

L’extinction du signal de fluorescence du chlorure de NBD dans l’acétonitrile et la formation d’un dérivé fluorescent avec l’histamine dans ce solvant nous a conduit à utiliser ce sensibilisateur comme marqueur fluorogénique en vue de la détermination du taux d’histamine dans les produits halieutiques.

Les méthodes fluorimétriques

Sensibilité

Le choix des méthode fluorimétriques se justifie par sa très grande sensibilité (100 à 10000 fois plus sensible que les méthodes d’absorption UV visible avec un domaine de linéarité 1000 fois plus grand) [8,11,17,19]. En plus, les méthodes fluorimétriques permettent de faire plusieurs dosages de faibles quantités de substances (de l’ordre du µg).

Sélectivité

Avec les méthodes fluorimétriques, il est possible de doser des substances fluorescentes en présence d’autres non fluorescentes. Aussi il est possible avec ces méthodes d’analyser une substance fluorescente en présence d’autres substances fluorescentes si les longueurs d’ondes d’excitation et / ou d’émission sont suffisamment éloignées.