Etude d’association génome entier sur les formes simples de paludisme

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Evolution naturelle de la maladie

La phase hépatique, qui suit l’inoculation des parasites, est asymptomatique. Les premiers symptômes cliniques apparaissent lors de la phase érythrocytaire. Lorsque les hématies infectées sont lysées, elles libèrent dans le sang les parasites ainsi que des substances toxiques (dont l’hémozoïne) qui sont en partie responsables de la fièvre et des symptômes. C’est aussi durant cette phase que la maladie peut être diagnostiquée, lorsque les parasites circulent dans le sang périphérique. Le diagnostic est généralement effectué au moyen d’une goutte épaisse (une goutte de sang étalée sur une lame de verre, examinée par microscopie) ou par un test de diagnostic rapide (TDR), qui permet de détecter la présence d’antigènes spécifiques du parasite.
Les symptômes surviennent une dizaine de jours après l’infection pour les individus non immuns, cependant ils ne sont pas systématiques. Dans les régions endémiques, beaucoup d’individus, majoritairement des adultes mais également des enfants, peuvent être porteurs de parasites tout en restant asymptomatiques.
Les mécanismes conduisant ensuite aux formes graves ne sont pas totalement élucidés. Les accès graves, tels que définis par l’OMS (« WHO | Severe Malaria », 2014), représentent un ensemble hétérogène de syndromes cliniques incluant le neuropaludisme, l’anémie sévère, la détresse respiratoire ou l’acidose pour les plus fréquents. La sévérité de l’infection à P. falciparum est liée à plusieurs phénomènes qui peuvent se combiner : une multiplication excessive des parasites (hyperparasitémie), la destruction des globules rouges infectés (anémie grave), la cytoadhérence des hématies infectées et une dérégulation du système immunitaire entrainant une réponse pro-inflammatoire excessive. Le phénomène de cytoadhérence a été décrit plus particulièrement dans le cadre du neuropaludisme (Wassmer & Grau, 2017). Lors de l’infection, les parasites modifient la membrane des globules rouges en exprimant à leur surface plusieurs protéines. Les hématies infectées acquièrent ainsi la capacité à adhérer à l’endothélium des vaisseaux sanguins et aux autres globules (phénomène de rosetting) conduisant à la séquestration des parasites dans différents organes et tissus et en particulier dans le cerveau.

Développement de l’immunité protectrice

Dans les régions de transmission continue, une immunité protectrice partielle contre P. falciparum se développe durant l’enfance en réponse à des infections répétées (Doolan et al., 2009). Cette immunité, dite acquise, est complexe et lente à se mettre en place. Les jeunes enfants acquièrent d’abord une immunité clinique, qui leur permet de contrôler la maladie, c’est-à-dire de réduire les risques de complications et de décès pour un niveau de parasitémie donné. Une immunité dite anti-parasitaire se met ensuite en place conduisant au contrôle du niveau de parasitémie. A l’âge adulte, les hauts niveaux d’immunité acquise permettent de contrôler la parasitémie à des densités relativement faibles. Aussi dans ces régions, la majorité des adultes, quand ils sont infectés, sont asymptomatiques et les cas de paludisme graves concernent essentiellement les jeunes enfants de moins de cinq ans.
Il n’existe pas à l’heure actuelle de consensus sur les déterminants majeurs de cette immunité ni sur les mécanismes à l’œuvre (Crompton et al., 2014; Doolan et al., 2009). Les anticorps y jouent un rôle prépondérant ainsi que d’autres cellules immunitaires telles que les cellules T et les cellules NK (Natural Killer). L’immunité acquise peut intervenir à différents niveaux du cycle de P. falciparum.
L’immunité acquise naturelle au stade hépatique semble relativement faible mais elle peut être induite, par exemple par l’inoculation de sporozoïtes atténués, ayant la capacité d’infecter le foie mais pas de s’y répliquer. Le vaccin RTS,S, également, vise à stimuler la production d’anticorps à ce stade et à empêcher les parasites d’envahir et de se développer dans les hépatocytes. Il cible une protéine de surface du sporozoïte, la CSP (pour circumsporozoite protein). L’importance de l’immunité acquise naturelle au stade érythrocytaire et le rôle clé joué par les anticorps à ce stade ont été démontrés dans les années 1960 par Cohen et ses collaborateurs, qui ont montré que le transfert d’immunoglobulines G purifiées provenant d’adultes immuns à des enfants ayant développé un paludisme grave conduisait à une réduction rapide de la parasitémie et à une disparition de la fièvre. A ce stade, les anticorps ont la capacité de se fixer à la fois aux mérozoïtes qui sont libérés dans la circulation sanguine (les empêchant d’infecter de nouveaux globules rouges) et aux antigènes à la surface des hématies infectées, entrainant ensuite leur phagocytose. Cette réponse anticorps n’est efficace qu’après plusieurs années d’infections répétées, du fait de la diversité génétique des protéines de P. falciparum et de la capacité du parasite à varier les protéines exprimées à la surface des globules rouges infectés. Les individus doivent être exposés de manière répétée à un nombre suffisant de clones de parasites avant de développer un répertoire d’anticorps permettant de les protéger.
Du fait de l’acquisition d’une immunité partielle protectrice au cours de l’enfance, les jeunes enfants apparaissent comme un groupe de population à privilégier pour identifier les facteurs de résistance innée au paludisme. En effet, chez les enfants ayant acquis un certain niveau d’immunité, le rythme d’acquisition de l’immunité ayant pu être différent d’un individu à l’autre, l’identification des facteurs innés de résistance est rendue plus complexe. Pour les formes graves de paludisme la plupart des études génétiques dans les régions fortement endémiques ont ciblé des enfants de moins de 5 ans. Pour les formes simples, quelques études ont porté sur des échantillons de très jeunes enfants uniquement, mais ces études ont souvent inclus des échantillons plus larges, incluant des adolescents ou des jeunes adultes, voire l’ensemble de la population.

Facteurs influençant la variabilité de présentation clinique

En résumé, l’infection à P. falciparum peut conduire à trois grandes formes de présentation clinique:
• Une infection asymptomatique (les individus sont porteurs de parasites mais ne présentent pas de symptôme clinique);
• Un accès palustre simple (caractérisé par la présence de parasites dans le sang accompagnée de symptômes cliniques dont la fièvre) ;
• Un accès palustre grave (caractérisé par la présence de parasites dans le sang accompagnée de symptômes cliniques et d’un ou plusieurs critères de sévérité).
Ces trois formes correspondent à différentes étapes dans la séquence de l’évolution naturelle de la maladie (Figure 1.4). Il n’est pas établi aujourd’hui si l’ensemble des accès graves surviennent à la suite d’un accès simple (transition C) ou si certaines infections évoluent directement en accès graves (transition D). Comme pour les maladies infectieuses de manière générale, de multiples facteurs peuvent influencer le risque d’infection, l’évolution de la maladie ainsi que sa présentation clinique. On peut distinguer deux grandes catégories de facteurs pour le paludisme : les facteurs environnementaux (niveau d’exposition au vecteur, virulence des parasites) et les facteurs de l’hôte humain (facteurs comportementaux, niveau d’immunité et facteurs génétiques). Ces facteurs peuvent intervenir au niveau des différentes transitions (flèches A à D de la Figure 1.4), de l’inoculation des parasites aux formes graves.

Les facteurs environnementaux

Le niveau d’exposition au vecteur. Il joue un rôle essentiel dans le risque d’infection et dans le risque de développer la maladie. Le développement du moustique dépend des conditions climatiques (précipitations, température, humidité). Dans beaucoup de régions endémiques, même si la transmission est continue, l’intensité de celle-ci varie en fonction des saisons, avec un pic de transmission au moment de, ou juste après, la (ou les) saison(s) des pluies. En plus de cette variation saisonnière, il existe également de plus en plus d’évidence d’une hétérogénéité locale de l’exposition au vecteur entre des villages voisins et au sein d’un même village, qui explique en partie les variations du nombre d’infections chez les enfants (Bousema et al., 2010; Cottrell et al., 2012; Greenwood, 1989). Cette hétérogénéité locale apparait liée à des facteurs tels que l’environnement immédiat de la maison, la proximité d’un cours d’eau, le type de sol et le type de végétation (Cottrell et al., 2012).
La virulence du parasite. Le processus d’infection et les symptômes cliniques résultent d’une interaction complexe entre l’hôte et le parasite. La virulence de P. falciparum est liée à sa capacité à envahir et à proliférer à l’intérieur des globules rouges ainsi qu’à la capacité des globules rouges infectés à adhérer à la paroi des vaisseaux sanguins. La virulence de P. falciparum a été associée en particulier à l’expression de la protéine PfEMP1 (Plasmodium falciparum Erythrocyte Membrane Protein 1), protéine parasitaire exprimée à la surface des globules rouges infectés, qui intervient dans la séquestration des parasites (Smith et al., 1995). Cette protéine est codée par de multiples gènes var (une soixantaine) qui sont classés en plusieurs sous-catégories : groupes A, B, C, var1, var2csa et var3. Les formes grave de paludisme ont été associées chez les enfants en Afrique, à l’expression de sous-catégories spécifiques de gènes (groupe A et groupe B) ainsi qu’à l’expression de gènes var codant des motifs conservés de PfEMP1, appelés domaines cassettes (Berger et al., 2013; Lavstsen et al., 2012). Des variants au sein des gènes MSP-1 et MSP-2 (Merozoïte Surface Protein 1 et 2) de P. falciparum, qui jouent un rôle important dans l’invasion des globules rouges, ont été aussi impliqués dans les formes sévères (Ghanchi et al., 2015; Sahu et al., 2008).

Les facteurs de l’hôte

Les facteurs comportementaux. L’utilisation de mesures de protection contre le vecteur, telles que l’utilisation de moustiquaires ou la pulvérisation d’insecticide intra-domiciliaire au niveau du foyer, permet de réduire le risque d’infection. L’efficacité de ces deux outils a été mise en évidence au travers de nombreuses études. Dans les années 1990, une méta-analyse, considérant 10 études en Afrique subsaharienne, a estimé que l’utilisation d’une moustiquaire imprégnée d’insecticide à longue durée d’action permettait une réduction de 24% des infections par rapport à l’utilisation d’une moustiquaire non-imprégnée, et d’environ 50% comparé à des individus n’utilisant pas de moustiquaires (Choi et al., 1995). Plus récemment, une étude similaire pour la pulvérisation d’insecticides intra-domiciliaire, basée sur 13 études publiées en Afrique subsaharienne, indique une réduction du risque de 62% (Kim et al., 2012). D’autres comportements liés à des pratiques sociales ou culturelles peuvent intervenir sur le risque d’infection. Il est à noter également que le délai de prise en charge du paludisme, après l’apparition des premiers symptômes, a un impact sur la sévérité des symptômes.
Le niveau d’immunité. Comme nous l’avons déjà dit, une immunité protectrice partielle se met en place au cours de l’enfance, avec la répétition des infections. Aussi le risque de développer un accès grave, puis un accès simple diminue avec l’âge, et la majorité des infections chez les adultes sont asymptomatiques. Au niveau des populations, l’intensité de la transmission du paludisme va influencer la rapidité de mise en place de l’immunité acquise (Okiro et al., 2009; Snow et al., 1997).
Paludisme associé à la grossesse. Le paludisme pendant la grossesse, et en particulier l’infection placentaire, a été associé à une sensibilité accrue des enfants au paludisme pendant leur première année de vie. Plusieurs études ont trouvé de manière cohérente un effet de l’infection placentaire par P. falciparum sur le délai de survenue de la première infection palustre chez les jeunes enfants. Une des hypothèses qui ont été émises pour expliquer la sensibilité accrue aux infections des enfants nés de mère avec un placenta infecté, est un mécanisme de tolérance immunitaire chez les enfants en contact avec des antigènes parasitaires durant la vie in utero. Mais plusieurs autres facteurs, parmi lesquels l’intensité de la transmission du paludisme, peuvent être responsables de cette sensibilité plus importante. L’effet du paludisme associé à la grossesse sur la sensibilité de l’enfant au paludisme n’est cependant pas encore établi aujourd’hui. Dans une revue récente sur le sujet, Kakuru et al. (Kakuru et al., 2019) estiment que les preuves en faveur d’ un mécanisme de tolérance immunitaire sont limitées, une seule étude ayant pris en compte l’intensité de la transmission dans les analyses (Le Port et al., 2011). Cette étude a été réalisée au sein de notre unité de recherche et a porté sur une des deux cohortes (celle de Tori-Bossito) inclues dans les analyses de ce manuscrit. Elle montre un effet significatif de l’infection placentaire sur le délai de survenue de la première infection (rapport des risques instantanés, RRI = 2,13 [1.24-3.67], p < 0.01). Cependant nous avons montré sur cette même cohorte que l’infection placentaire n’apparaissait pas liée à un risque d’infection plus élevé d’accès palustre, après ce premier accès (Bouaziz et al., 2018).
Les facteurs génétiques de l’hôte qui nous intéressent plus particulièrement sont développés dans la partie suivante. Ces facteurs peuvent intervenir au niveau des différentes transitions du schéma de la Figure 1.4. Ils peuvent être impliqués dans des mécanismes de résistance innée au paludisme ou dans le développement de l’immunité protectrice.

Facteurs génétiques de l’hôte

Un peu d’histoire

La drépanocytose et autres anomalies du globule rouge
On s’est intéressé très tôt aux facteurs génétiques de l’hôte humain impliqués dans la résistance au paludisme. Les généticiens des populations J. B. S. Haldane et G. Montalenti, dès 1949, constatant la superposition de la distribution de la thalassémie et du paludisme dans le sud de l’Europe (Italie, Sicile et Grèce), proposent que le fait d’être hétérozygote (porteur d’un seul allèle délétère) pour la thalassémie confère un avantage sélectif, et que le paludisme ait été la pression de sélection à l’origine des fréquences élevées de la thalassémie dans cette région (Haldane, 1949). Avec cette hypothèse, bien connue sous le nom de Malaria Hypothesis, J. B. S Haldane suggère pour la première fois le concept de résistance génétique aux infections (Weatherall, 2004). Presque simultanéement, A. C. Allison observe au Kenya que les individus porteurs du trait drépanocytaire (non malades mais qui présentent des caractéristiques intermédiaires au niveau des globules rouges) sont présents à une fréquence anormalement élevée uniquement dans les régions où sévit le paludisme. A cette époque, le gène responsable de la drépanocytose n’est pas connu, mais deux articles (Beet, 1949; Neel, 1949) ont montré de manière indépendante que la drépanocytose était une maladie héréditaire et que les porteurs du trait drépanocytaire étaient hétérozygotes pour l’allèle délétère, et les individus malades homozygotes (porteurs de deux allèles). Les travaux d’A. C. Allison, publiés un peu plus d’une dizaine d’années plus tard, apporteront un ensemble d’éléments confirmant l’hypothèse de protection des individus hétérozygotes. Ils montrent notamment que les individus porteurs du trait drépanocytaire sont moins infectés par P. falciparum (Allison, 1954).
Il a été établi par la suite que la drépanocytose était due à un variant du gène HBB, codant pour la chaîne β de l’hémoglobine conduisant à la production d’une hémoglobine anormale (hémoglobine S, HbS). Les individus homozygotes pour HbS souffrent de la drépanocytose, maladie qui entraine une déformation des globules rouges avec des conséquences physiologiques très importantes et associée longtemps à une forte probabilité de décès avant l’âge de cinq ans dans les régions endémiques. Les individus hétérozygotes par contre, présentent très peu de symptômes et ont un risque dix fois moindre de faire un accès grave (Ackerman et al., 2005; Hill et al., 1991). L’hémoglobine S est un cas d’école de sélection balancée dans les populations humaines sur lequel nous reviendrons dans la partie concernant la sélection naturelle.
A la suite des découvertes d’Allison, d’autres anomalies du globule rouge présentant des fréquences anormalement élevées dans des régions endémiques sont étudiées (Nagel & Roth, 1989). Il s’agit de deux autres variants du gène HBB, HbE (Flatz, 1967) et HbC (Labie et al., 1984), de variants impliqués dans la régulation de l’expression des gènes HBB et HBA (codant pour la chaîne α de l’hémoglobine) impliqués respectivement dans la β-thalassémie et l’α-thalassémie, d’un variant dans la protéine SLC4A1 (ou protéine Bande 3) codant pour le groupe sanguin Diego et responsable de l’ovalocytose (Amato & Booth, 1977) et des variants dans le gène G6PD (Glucose-6-Phosphate Déshydrogénase) entrainant un déficit de cette enzyme impliquée dans la résistance des globules rouges au stress oxydatif (Bienzle et al., 1972).
Caractérisation des facteurs génétiques
Pour identifier le rôle des facteurs génétiques, les premières études se basent sur des méthodes épidémiologiques. L’association entre les variants génétiques et le(s) trait(s) relatif(s) à la maladie, appelé(s) phénotype(s) en génétique, est testée dans des études cas-témoins. Ces études contrastent les fréquences alléliques entre un échantillon de cas (individus malades, ou présentant des caractères de gravité, par exemple une forte densité parasitaire) et des individus sains (non malades, ou avec des symptômes modérés, appelés témoins).
A partir des années 1990, d’autres approches, spécifiques à la génétique, telles que l’analyse de ségrégation et l’étude de jumeaux sont utilisées. L’analyse de ségrégation étudie la transmission du phénotype au sein des familles et permet de déterminer s’il existe un gène avec un effet majeur parmi les différentes sources de corrélation familiale (Demenais et al., 1996). Les trois études réalisées ont montré l’effet d’un gène majeur dans le contrôle de la densité parasitaire dans le sang au Cameroun (Abel et al., 1992; Garcia, Cot, et al., 1998) et au Burkina Faso (P. Rihet, Abel, et al., 1998) et dans différents contextes de transmission, en milieu rural et urbain (P. Rihet, Abel, et al., 1998). Si la première étude met en évidence le rôle d’un facteur génétique avec un mode de transmission récessif, les deux études suivantes (Garcia, Cot, et al., 1998; P. Rihet, Abel, et al., 1998) s’accordent sur le fait que les résultats obtenus ne sont pas compatibles avec la transmission mendélienne d’un seul gène, et concluent à l’existence d’un contrôle génétique complexe pour les niveaux d’infection dans le sang. Les études de jumeaux comparent les similitudes de phénotype entre des jumeaux monozygotes (ou vrais jumeaux qui sont identiques au niveau de leur séquence ADN) et les jumeaux dizygotes (ou faux-jumeaux, qui partagent comme des frères et sœurs, en moyenne 50% de leurs gènes). Elles sont utilisées afin de distinguer les rôles respectifs des facteurs génétiques et des facteurs environnementaux, en faisant l’hypothèse que l’environnement partagé entre jumeaux monozygotes et jumeaux dizygotes est le même. Jepson et al. (A. P. Jepson et al., 1995) ont réalisé un suivi longitudinal (suivi des individus en population sur une certaine période de temps) chez des paires de jumeaux en Gambie durant une saison de transmission. Cette étude a montré une corrélation significativement plus importante chez les jumeaux monozygotes que chez les jumeaux dizygotes pour le développement d’un accès palustre, indiquant que le développement d’une infection fébrile était au moins en partie génétiquement déterminé. L’ensemble de ces études familiales ont confirmé le rôle des facteurs génétiques dans le contrôle de la densité parasitaire et dans la survenue des accès simples.

Table des matières

1 Introduction
1.1 Le paludisme
1.1.1 Répartition géographique
1.1.2 Evolution depuis les années 2000
1.1.3 Les défis actuels de la lutte contre le paludisme
1.2 Infection à Plasmodium falciparum
1.2.1 Cycle du parasite
1.2.2 Evolution naturelle de la maladie
1.2.3 Développement de l’immunité protectrice
1.2.4 Facteurs influençant la variabilité de présentation clinique
1.3 Facteurs génétiques de l’hôte
1.3.1 Un peu d’histoire
1.3.2 La région 5q31-q33 et la région HLA
1.3.3 Les études d’association gènes candidats
1.3.4 Les approches génome entier
1.3.5 Prise en compte de la stratification de population dans les GWAS
1.4 Le paludisme : pression de sélection au cours de l’histoire récente des populations humaines
1.4.1 Les différentes formes de sélection naturelle
1.4.2 Détection des signatures de sélection récente à partir des données génétiques
1.4.3 Des exemples de sélection balancée ou positive exercées par le paludisme
1.4.4 Approches génome entier
1.5 Problématique et objectifs
2 Les données
2.1 Les suivis de cohortes
2.1.1 La cohorte de Tori-Bossito
2.1.2 La cohorte d’Allada
2.2 Contrôle qualité des données
2.2.1 Les données du suivi palustre
2.2.2 Les données génétiques
2.3 Stratification de population
2.3.1 Analyse en composantes principales sur les deux cohortes
2.3.2 Analyse en composantes principales incluant des populations africaines du projet 1000 Génomes
3 Etude d’association génome entier sur les formes simples de paludisme
3.1 Les modèles mixtes
3.1.1 Le modèle linaire mixte pour la prise en compte de la structure de population
3.1.2 Le modèle de Cox mixte
3.1.3 Stratégie d’analyse en deux étapes de la GWAS
3.2 Résultats
3.2.1 Le suivi palustre dans les deux cohortes
3.2.2 Ajustement sur les facteurs individuels et environnementaux
3.2.3 Analyse d’association génome entier
3.2.4 Analyse fonctionnelle in silico
3.3 Discussion
4 Modèle logistique mixte pour la correction de la structure de populations dans les GWAS
4.1 Adéquation des méthodes existantes pour l’analyse des données du Sud Bénin
4.1.1 Methodes
4.1.2 Résultats
4.2 Méthodes proposées pour l’estimation des effets des SNPs
4.2.1 Les méthodes AMLE et Offset
4.2.2 Evaluation du comportement des méthodes approchées
4.2.3 Résultats
4.3 Discussion
5 Identification des signaux de sélection naturelle récente
5.1 Méthodes
5.1.1 Phasage des données génotypiques et filtre des données
5.1.2 Tests de sélection naturelle positive ou balancée récente
5.1.3 Co-localisation des signaux d’association et de sélection
5.2 Résultats
5.2.1 Vue d’ensemble des résultats sur le génome entier
5.2.2 Analyse par fenêtres de 100 kb
5.2.3 Co-localisation des signaux d’association et de sélection
5.3 Discussion
6 Discussion et perspectives
Références
ANNEXES
Annexe 1 : Les études d’association gènes candidats
Définition des cinq régions en Afrique
Gènes associés avec les formes graves de paludisme
Annexe 2 : Données sur les infections palustres dans les deux cohortes
Annexe 3 : Articles
Article 1
Article 2

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