Etude biologique et phytochimique de trois genêts endémiques

Etude biologique et phytochimique de trois genêts
endémiques

Caractères morpho-anatomiques des trios genêts

Phénologie

«La phénologie végétale est l’étude scientifique des variations saisonnières, de lacroissance et du développement des plantes» (Schnelle, 1955). Celle-ci étudie les cycles biologiques et leurs liens avec les conditions climatiques. Ces événements se produisent chaque année à la même époque, mais leur date exacte varie d’année en année. Depuis 2011 nous avons noté le début et la fin de chacune des phases: végétative et reproductrice.

Morphologie

L’observation des différentes parties de la plante à l’œil nu et sous binoculaire (Zeiss), nous a permis de déterminer les caractères morphologiques des feuilles et des tiges des trois éspèces de Genista.

Structure anatomique Matériels et méthodes

Cette étude a un double intérêt: *Mettre en évidence les différents types tissulaires des plantes étudieés. *Etudier l’expression anatomique de Genista en rapport avec son biotope naturel. L’étude histologique a porté sur la feuille et la tige jeune des 03 espèces. Les échantillons ont été récupérés dans l’éthanol dilué immédiatement après la récolte.  Mode opératoire Pour pouvoir étudier la structure anatomique des organes végétaux, il est nécessaire de savoir effectuer des coupes minces et parfaitement orientées et de pratiquer différentes colorations (Deysson, 1965). La double coloration au vert de méthyle-rouge Congo (Langeron, 1934) comprend les différentes étapes suivantes: 1. Traitement par une solution d’hypochlorite de sodium à 12° pendant 15 minutes quidétruira le contenu des cellules à l’exception des parois et des membranes cellulaires. 2. Lavage soigné et répété à l’eau distillée. 3. Traitement par l’acide acétique pendant trois minutes; cet acide détruira les traces d’hypochlorite pouvant rester encore et facilitera la fixation ultérieure des colorants sur les membranes (Deyson, 1965). 4. Lavage soigné et répété à l’eau distillée 5. Traitement par le vert de méthyle à 1 %, pendant 03 minutes; ce réactif colore en vert les tissus sclérifiés et en jaune verdâtre ou brun verdâtre la cutine et les parois subérifiées. 6. Lavage rapide et répété à l’eau distillée pour éliminer l’excès de colorant. 7. Traitement par le rouge Congo à 1% pendant 03 minutes; ce réactif colore en rose les tissus cellulosiques, en se fixant sur les glucanes (cellulose = polymère de glucane). 8. Lavage rapide et répété à l’eau distillée pour éliminer l’excès de colorant. 9. Montage entre lame et lamelle dans une goutte d’eau distillée pour observation immédiate au microscope. 10. Observation des coupes sous microscope photonique pour prise de photos aux grossissements x10 et x40. 

Détermination de la matiere sèche, matiere minérale et la teneur en eau

Détermination de la matière sèche: La matière sèche (MS) constitue la partie d’un produit végétal qui reste une fois que l’eau en a été totalement extraite. Elle est determinée par séchage à l’étuve ventilée de l’échantillon.  Dans un creuset en porcelaine préalablement sèché, peser une masse (m) d’échantillon.  Mettre dans l’étuve a 105°C jusqu’a obtenir une masse d’échantillon constante.  Refroidir dans un déssiccateur et peser l’ensemble de masse(m0).  Déterminer le pourcentage en matiere sèche: %MS = m0 /m x 100  Détermination de la matière minérale La matiere minérale (MM) represente la partie d’un produit végétal qui reste une fois que la matière organique en a été totalement extraite. Elle est determinée par calcination de l’échantillon.  Placer l’échantillon (m) sec dans un four à moufle porté à 550°C pendant 4-5 heures.  Refroidir dans un dessiccateur et peser l’ensemble de masse MM.  Déterminer le pourcentage de matière minérale : %MM = MM / m x 100  Détermination de la teneur en eau des feuilles. Le taux d’humidité des feuilles de nos échantillons, à été déterminé par le procédé de dessiccation à une température de 105° C dans une étuve isotherme ventilée à la pression atmosphérique jusqu’à l’obtention d’un poids constant (Linden et Lorient ,1994). X-Y T% = *100 Y Matériels et méthodes 49 Considérons : X- Poids de l’échantillon ; Y-Poids de l’échantillon après déshydratation ; T% Taux d’humidité exprimé en pourcentage ; 5.2. Analyse quantitative des éléments minéraux des plantes étudieés Les éléments minéraux étudiés ont été dosés dans les cendres des feuilles et des fleurs des 03genêts.Le dosage des éléments étudiés (N,Ca+2, K+2,Na+ , Mg+ , P, Fe) a été réalisé par les mêmes méthodes utilisées dans les analyses des sols. 

Screening phytochimique

Très peu d’études ont été consacrées à ces trois taxons, c’est pourquoi un screening phytochimique s’est imposé. Ce screening a concerné les feuilles et les fleurs.  Recherche des Tanins : Nous avons pris 5 ml de l’infusé (10g de drogue en petites fragments dans 100 ml d’eau bouillante), nous avons ajouté goutte à goutte 1ml d’une solution de chlorure ferrique (Fe Cl3) à 1%. L’apparition d’une coloration verdâtre indique la présence des Tanins catéchiques, bleu-noirâtre, des Tanins galliques(Solfo, 1973).  Recherche des Anthocyanes : La recherche des Anthocyanes repose sur le changement de couleur de l’infusé à 10% avec le changement de pH.Nous avons ajouté à 5ml de l’infusé quelque gouttes de HCl pur et nous avons observé le changement de couleur, ensuite nous avons rajouté quelques gouttes de NH4OH Le changement de couleur indique la présence d’Anthocyanes (Solfo, 1973).  Recherche des Leuco-anthocyanes : Nous avons pris 5 ml de l’infusé, mélangé à 4 ml d’alcool chlorhydrique (éthanol / HCl pur 3/1 v/v) après chauffage au bain-marie à 50°C pendant quelques minutes. L’apparition d’une couleur rouge-cerise indique la présence des Leucoanthocyanes(Solfo, 1973). Matériels et méthodes 50  Recherche des Alcaloïdes 5 g de la plante séchée et broyée sont mélangés avec 50 ml d’HCl dans un récipient; après macération nous avons filtré le mélange et additionné au filtrat quelques outtes de réactif de Mayer. L’apparition d’un précipité blanc indique la présence d’alcaloïdes(Bouquet, 1972).  Recherche des Flavonoïdes : 10g de drogue pulvérisée sont macérés dans 150 ml d’HCl à 1% pendant 24 heures ; après avoir filtré le mélange, nous avons procédé au test suivant : nous avons prit 10 ml du filtrat, après l’avoir rendu basique en ajoutant du NH4OH ; après 3 heures. L’apparition d’une couleur jaune claire dans la partie supérieure du tube indique la présence des Flavonoïdes(Mellouk, 2007).  Recherche des Terpènes et des Stérols : Elle se fait sur une macération de 24 h à 5 % dans l’éther. L’extrait éthérique estensuite évaporé à sec et repris avec de l’anhydride acétique puis du chloroforme. Déposer au font du tube contenant l’extrait de l’acide sulfurique. En cas de réaction positive il se formeun anneau rouge-brunâtre ou violet à la zone de contact des deux liquides, la couche surnageante était verte ou violette (Trease et Evans, 1987).  Recherche des composés réducteurs: Leur détection consiste à traiter 1 ml de l’extrait éthanolique avec 2 ml d’eau distilléeet 20 gouttes de la liqueur de Fehling, puis chauffer. Un test positif est révélé par laformation d’un précipité rouge-brique (Trease et Evans, 1987).  Recherche des saponosides: La détection des saponosides est réalisée en ajoutant un peu d’eau à 2 ml de l’extrait aqueux, puis la solution est fortement agitée. Ensuite, le mélange est laissé pendant 20minutes et la teneur en saponosides est évaluée par une hauteur de mousse persistante, supérieure à 1 cm indiquant la présence de saponosides (Trease et Evans, 1987).  Recherche des coumarines: 1 g d’échantillon de la poudre végétale est placé dans un tube à essai en présence dequelques gouttes d’eau distillée. Le tube est recouvert avec un papier imbibé d’une solution de NaOH et porté dans un bain Marie pendant quelques minutes. Puis on ajoute 0,5 ml de NH4OH dilué (10%) et on va mettre deux taches sur un papier filtre qui sont examinées sous la lumière ultraviolette. La fluorescence des taches confirme la présence des coumarines (Rizk ,1982). 6/ Etude thérapeutique 6.1. Extractionet calcul du redement des métabolites secondaires:  Les flavonoïdes: Les flavonoïdes ont été extraits selon la méthode de (Charaux-Paris, 1954). 10g de drogue séchée, sont stabilisés pendant une heure dans 200 ml d’éthanol bouillant ; après filtration et séchage, la drogue est pulvérisée grossièrement et épuisée à l’appareil de Soxhlet par 200 ml d’éthanol à 96° C pendant 4heures ; après une nuit de macération, les deux solutions éthanoliques sont mélangées et évaporées sous pression réduite. Le résidu est repris par 20ml d’eau bouillante, la solution aqueuse est laissée au repos pendant 24heures et la liqueur est épuisée dans une ampoule à décantation, plusieurs fois, successivement par :(4x10ml) d’éther; puis (4x10ml) d’acétate d’éthyle et à la fin avec (5x10ml) du n-butanol.  Tanins: L’extraction des tanins a été effectuée selon la méthode adaptée par(Zhang et al, 2008)2,5g de poudre de matériel végétal (feuille, fleur) a été extraite par 50 ml du mélange acétone/eau distillée (35/15, V/V) durant trois jours à une température ambiante. La solution est filtrée et évaporée à 40°C par un rotavapeur type buchi 200 pour éliminer l’acétone puis, la phase aqueuse est lavée par 15 ml de dichlorométhane afin d’éliminer les pigments et les lipides. Après la séparation de la phase organique, la phase aqueuse a été extraite deux fois avec 15 ml d’acétate d’éthyle. Le mélange des deux phases est évaporé à sec à 40°C par unrotavapeur type Buchi R-200 puis pesé et repris par 3 ml de méthanol. Les saponines : Les saponines ont été extraits selon la méthode élaborée (Applebraun et al, 1969), légèrement modifiée ; Le broyat de la plante à été delipidé durant 2heures par 50 ml du n-hexane pur pour analyse. Après élimination de la phase organique, le précipité obtenu à été macéré dans 60 ml d’éthanol absolu sous agitation magnétique à la température ambiante pendant 24 h.La phase éthanolique à été évaporée à sec sous vide à 40°C par le rota-vapeur ; le résidu sec à été extrait 03 fois par 20 ml du mélange eau distillée 10 ml / éther de pétrole 10 ml et chauffé à 50°C dans un bain Marie pendant 30 mn, les phases aqueuses ont été mélangées puis reprises par 30ml du n-butanol pendant 30mn , la phase organique est évaporée à sec à 40°C par le rotavapeur.Les saponosides seront testées sur quelques bactéries.  Préparation des extraits méthanoliques Les fleurs, les feuilles et les plantes entières des espèces G. numidica, G. ferox et G. tricuspidatapréalablement nettoyées et broyées ont été mises à macérer dans le méthanol (2g dans 200 ml) sous agitation douce pendant24 heures à température ambiante. Les extraits alcooliquesont été récupérés après filtration des mélanges à l’aide d’un papier filtre, le méthanol est éliminé des filtrats par évaporation sous pression réduite dans un rota-évapeur (BÜCHI). Permettant ainsi d’obtenir des extraits qui sont considérés comme étant les extraits bruts. Le rendement de l’extraction est calculé par la formule donnée(Falleh et al, 2008): R (%) = 100 Mext/Méch. Où : R est le rendement en %; Mext est la masse de l’extrait après évaporation du solvant en mg et Méch est la masse sèche de l’échantillon végétal en mg.